Electroforeza proteinelor într-un gel de poliacrilamidă este o metodă de separare a amestecurilor de proteine într-un gel de poliacrilamidă în funcție de mobilitatea lor electroforetică (o funcție a lungimii lanțului polipeptidic sau a greutății moleculare , precum și a plierii moleculei proteice, post-translațional). modificări și alți factori). Această metodă de fracţionare a proteinelor şi peptidelor este utilizată pe scară largă în biologia moleculară modernă , biochimie şi genetică .
Un număr mare de modificări ale electroforezei proteinelor în gel de poliacrilamidă au fost dezvoltate pentru a rezolva diverse probleme și pentru diferite proteine și peptide. Cea mai comună varietate este electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă în prezența dodecil sulfatului de sodiu conform Laemmli ( SDS PAGE ) .
Mobilitatea electroforetică a biopolimerilor într-un gel depinde de un număr de parametri. Viteza de migrare este proporțională cu sarcina moleculei, iar într-un lichid liber, moleculele cu aceeași sarcină specifică migrează cu aceeași viteză. În cazul separării într-un mediu cu o matrice spațială rigidă, segregarea are loc datorită frecării cu gelul. Forța de frecare depinde de configurația spațială a moleculei, inclusiv de dimensiunea acesteia. Astfel, în cazul separării electroforetice a proteinelor native, se va observa un model complex de distribuție a acestora în funcție de factorii de mai sus.
În 1970, Laemmli a propus o metodă de separare electroforetică a proteinelor într-un gel de poliacrilamidă în funcție de greutatea moleculară pentru a studia procesul de asamblare a capsidei bacteriofagului T4 [1] . Pentru a face acest lucru, înainte de aplicarea pe gel, probele au fost fierte în prezență de dodecil sulfat de sodiu (SDS) și 2-mercaptoetanol. Sub influența 2-mercaptoetanolului , legăturile disulfurice sunt restabilite, ceea ce împiedică polipeptidele denaturate să se extindă și să le mărească mobilitatea. SDS este un detergent puternic , molecula sa constă dintr-un lanț alifatic drept cu doisprezece membri și un sulfat legat covalent de acesta, care are o sarcină negativă în soluție.
Când se utilizează metoda descrisă, se fac următoarele ipoteze:
În aceste condiții, toate polipeptidele au aceeași sarcină specifică și se separă invers cu logaritmul greutății lor moleculare. Practica confirmă corectitudinea acestor ipoteze în marea majoritate a cazurilor.
Pentru a efectua electroforeza de denaturare în PAAG , sunt utilizate diferite sisteme tampon. Cel mai comun sistem implicit este sistemul tampon Laemmli. În plus, marea majoritate a lucrărilor folosesc așa-numita electroforeză disc (din engleză discontinuous - discontinuous), adică folosesc un gel format din două părți. Gelul de concentrare are un pH de 6,8 și o concentrație de poliacrilamidă de la 2 la 8%. Gelul de separare are un pH în regiunea 8,5-9 și o concentrație de poliacrilamidă de la 5 la 20%. Alegerea densității gelului depinde de greutățile moleculare ale proteinelor studiate. Toate tampoanele nu conțin săruri anorganice; principalul purtător de curent din ele este glicina . La pH 6,8, sarcina totală a moleculei de glicină este aproape de zero. Ca urmare, pentru a transfera o anumită sarcină (care este determinată de puterea curentului din celula electroforetică), complexele de polipeptide încărcate negativ cu SDS trebuie să se miște cu viteză mare. La pH 8,8, glicina capătă o sarcină negativă, în urma căreia proteinele sunt puternic inhibate la limita gelurilor de concentrare și separare (mult mai multe molecule încărcate sunt acum implicate în transferul aceleiași sarcini printr-o unitate de suprafață, prin urmare, se deplasează cu o viteză mai mică). Rezultatul este concentrația de proteine la interfața gelurilor, ceea ce mărește foarte mult rezoluția metodei.
Într -un gel de separare , proteinele migrează în funcție de lungimea lanțului polipeptidic, adică invers proporțional cu greutatea moleculară.
Pentru a vizualiza rezultatele electroforezei, cel mai des este folosită colorarea proteinelor în geluri cu colorant Coomassie sau argint . Pentru Western blot , proteinele sunt transferate din gel pe o membrană de nitroceluloză.
În majoritatea cazurilor, este suficient să se obțină rezultatele separării electroforetice prin evaluarea vizuală a gelului. Cu toate acestea, pentru a obține date fiabile și a documenta în mod corespunzător rezultatele, gelul este scanat prin transmisie folosind un densitometru foarte sensibil. De fapt, un densitometru este un scanner care aparține instrumentelor de control și măsurare și este supus verificării pentru a determina și confirma că caracteristicile instrumentului de măsurare îndeplinesc cerințele stabilite. Astfel de cerințe pentru un densitometru permit să se determine în mod fiabil nu numai poziția proteinelor în gel, ci și densitatea optică a spotului proteic. Imaginea digitizată a gelului este procesată folosind un software specializat care vă permite să determinați în mod fiabil parametri cum ar fi mobilitatea electroforetică a proteinei, puritatea acesteia, cantitatea de proteină în fața locului etc.
Determinarea masei moleculare a proteinelorDeterminarea greutății moleculare a proteinei studiate necesită calibrarea gelului în funcție de greutăți moleculare. Gelul este calibrat în funcție de greutățile moleculare ale proteinelor marker, care sunt separate în paralel cu proba de testat. Amestecuri de proteine marker sunt disponibile în diferite intervale de greutate. Calibrarea implică reprezentarea grafică a dependenței mobilității electroforetice relative (Rf) a fiecăreia dintre proteinele marker de logaritmul zecimal al greutății lor moleculare. De obicei, dependența are forma unei curbe sigmoide. Calculul greutății moleculare a proteinei studiate se efectuează în raport cu Rf ei, folosind metoda analizei de regresie . Rezultatele sunt considerate fiabile dacă intervalul de proteine marker este de cel puțin 80% din lungimea gelului de separare, iar dependența Rf lor de logaritmul greutății moleculare este liniară (R2 > 0,95). Adică, numai acea secțiune a curbei de calibrare este utilizată pentru calcule, care acoperă mobilitatea electroforetică a proteinei studiate.
Sensibilitatea metodei SDS-PAGE conform lui Laemmli este invers proporțională cu greutatea moleculară a proteinei. De exemplu, în intervalul 10-20 kDa , este posibil să se separe proteinele care diferă doar cu 0,1 kDa (diferența este doar un rest de aminoacid ). Cu toate acestea, pentru a obține rezultate satisfăcătoare, trebuie urmate câteva recomandări metodologice simple. Astfel, datorită faptului că conductivitatea electrică ridicată a probelor studiate poate distorsiona semnificativ mobilitatea electroforetică a proteinei, puterea ionică a acestora ar trebui să fie cât mai mică posibil și aproximativ egală. O altă condiție importantă pentru fiabilitatea determinării greutății moleculare este încărcarea optimă a proteinei pe gel. La colorarea cu Coomassie Blue R250, conținutul optim de proteine într-un loc ar trebui să fie în intervalul 0,1-1 µg și cel puțin cu un ordin de mărime mai mic atunci când este colorat cu argint. În caz contrar, proteinele din gel vor forma pete largi, ceea ce face dificilă determinarea mobilității lor electroforetice. În ciuda sensibilității ridicate și simplității metodei, greutatea moleculară a proteinelor determinată folosind SDS-PAGE diferă adesea de valoarea reală. Diferența poate varia de la câțiva kDa pentru proteinele cu greutate moleculară mică până la zeci de kDa pentru proteinele cu greutate moleculară mare.
Cuantificarea proteinelorMetoda SDS-PAGE este indispensabilă dacă este necesară cuantificarea unei proteine individuale într-o probă care este complexă nu numai în compoziția proteinei. Un exemplu de astfel de probă ar fi extractele brute sau lizatele celulare. În acest caz, metoda este potrivită pentru studierea atât a proteinelor native, cât și a proteinelor care și-au schimbat structura. Astfel de proteine pot fi polimeri, agregate sau molecule complet denaturate. Natura relativ nesolicitantă a metodei în ceea ce privește compoziția probei și starea structurală a proteinelor din aceasta distinge favorabil SDS-PAGE de alte metode de determinare cantitativă, de exemplu, cromatografia lichidă de înaltă performanță sau imunotestul enzimatic.
Cuantificarea proteinei folosind SDS-PAGE sugerează necesitatea de a calibra gelul în raport cu dependența intensității de culoare a petei proteice din gel de cantitatea de proteină din acest punct. Pentru a face acest lucru, în paralel cu probele studiate, mai multe probe de referință sunt separate în gel cu cantități diferite cunoscute precis de proteină de referință. După vizualizarea proteinelor din gel cu ajutorul unui densitometru, se măsoară densitatea fiecărui punct proteic din probele de referință. Determinați dependența acestei densități de cantitatea de proteine. Gelul calibrat este utilizat pentru a calcula cantitatea de proteină studiată în raport cu densitatea spotului său, folosind metoda analizei de regresie . Rezultate fiabile sunt luate în considerare dacă dependența densității petelor proteice pentru proteina de referință de cantitatea de proteină din spot este liniară (R2 > 0,95). Adică, pentru calcule, se folosește doar acea secțiune a curbei de calibrare care acoperă densitatea spotului proteinei studiate. Trebuie remarcat faptul că selectarea concentrației optime de proteine în proba de testat se realizează empiric.
La cuantificarea proteinelor folosind SDS-PAGE, trebuie luată în considerare o caracteristică semnificativă a acestei metode. Deci, datorită faptului că eficiența colorării unei proteine într-un gel depinde de natura acesteia, de exemplu, compoziția de aminoacizi, greutatea moleculară, prezența grupelor protetice , proteina de referință utilizată pentru calibrarea gelului și proteina studiată trebuie să fi identic. În cazul abaterii de la această regulă, diferența dintre suma adevărată și cea primită poate diferi de câteva ori.
Determinarea impurităților proteiceMetoda SDS-PAGE conform lui Laemmli permite cuantificarea conținutului doar a acelor impurități care diferă în greutatea lor moleculară de greutatea moleculară a proteinei studiate. Pentru a face acest lucru, proba de testat este separată într-un gel în paralel cu una sau mai multe probe de referință, cantitatea de proteină de referință în care este comparabilă cu cantitatea așteptată de impurități din soluția de proteină de testat. De exemplu, dacă concentrația de proteină din proba de testat este de 1 mg/ml, iar cantitatea așteptată de impurități din aceasta este de 1%, atunci cel puțin o soluție de proteină de referință cu o concentrație de 10 µg/ml este utilizată ca referință. probă. După vizualizarea proteinelor din gel cu ajutorul unui densitometru, se măsoară densitatea fiecărui spot proteic pentru proba de testat și proba de referință.
Metoda SDS-PAGE este potrivită pentru determinarea dimerilor proteici și a polimerilor care se acumulează datorită închiderii spontane a legăturilor disulfurice intermoleculare , de exemplu, în timpul depozitării necorespunzătoare a medicamentului. Pentru a face acest lucru, proteina studiată și proteina de referință sunt separate într-un gel în condiții reducătoare și nereducătoare. Impuritățile sunt dimeri și polimeri dacă sunt detectați în condiții reducătoare și nu sunt detectate în condiții nereducătoare. În acest caz, greutatea lor moleculară ar trebui să fie un multiplu al greutății moleculare a proteinei testate. Astfel, evaluarea purității unui preparat proteic prin SDS-PAGE în condiții reducătoare face posibilă determinarea numai a impurităților proteice neomoloage.
Rezultatele determinării purității unei probe pot fi fie semi-cantitative, fie cantitative. În cazul în care se realizează o comparație a densității petelor de proteine contaminante în raport cu un punct al unei proteine de referință, rezultatul obținut este semi-cantitativ. Formularea acestuia poate suna, de exemplu, după cum urmează: „Conținutul de impurități proteice din soluția de testat nu depășește 1%”. Determinarea cantitativă a impurităților proteice se realizează conform recomandărilor pentru determinarea cantitativă a proteinelor prin metoda SDS-PAGE.
Pe lângă abordările descrise, unele laboratoare practică o metodă de determinare a omogenității unui preparat fără a utiliza mostre de referință. În acest caz, puritatea proteinei studiate este determinată de densitatea petei din gel, care este estimată ca procent din suma densităților tuturor petelor de proteine identificate. Această abordare nu reflectă cantitatea reală de impurități, dar poate servi ca o evaluare calitativă a purității medicamentului. Metoda nu poate fi clasificată ca fiind cantitativă datorită faptului că numărul și densitatea petelor de proteine detectate este direct proporțională cu cantitatea de proteină totală din proba de testat și cu sensibilitatea metodei de determinare a proteinelor din gel. În plus, dependența densității unui spot proteic de cantitatea de proteină din acesta într-un interval care depășește un ordin de mărime nu este adesea liniară.
Pentru electroforeza proteinelor într-un gel de poliacrilamidă se folosesc următoarele soluții tampon : Tris - HCl , Tristricin , TBE , TBE cu uree, Bis-Tris.