Cultură de celule

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită pe 24 mai 2021; verificările necesită 5 modificări .

Cultura celulară este un proces prin care celulele individuale (sau o singură celulă) de procariote și eucariote sunt crescute in vitro în condiții controlate . În practică, termenul " cultură celulară " se referă în principal la cultivarea de celule unice derivate din eucariote multicelulare, cel mai frecvent animale. Dezvoltarea istorică a tehnologiei și tehnicilor de creștere a culturilor celulare este indisolubil legată de cultivarea culturilor de țesuturi și a organelor întregi.

Istorie

În secolul al XIX-lea, fiziologul englez S. Ringer a dezvoltat o soluție salină [1] care conține cloruri de sodiu, potasiu, calciu și magneziu pentru a menține bătăile inimii animalelor din afara corpului. În 1885, Wilhelm Roux a stabilit principiul culturii de țesuturi, a îndepărtat o parte din măduva osoasă dintr-un embrion de pui și a ținut-o în ser fiziologic cald timp de câteva zile [2] . Ross Granville Harrison , care a lucrat la Școala de Medicină Johns Hopkins și mai târziu la Universitatea Yale , a publicat rezultatele experimentelor sale în 1907-1910, creând o metodologie de cultură de țesuturi. În 1910, Peyton Rous , lucrând cu cultura de celule de sarcom de pui , a indus formarea de tumori la animalele sănătoase. Acest lucru a dus mai târziu la descoperirea virusurilor oncogene ( Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină 1966).

Tehnicile de cultură celulară s-au dezvoltat semnificativ în anii 1940 și 1950 în legătură cu cercetările din domeniul virologiei. Cultivarea virusurilor în culturi celulare a făcut posibilă obținerea de material viral pur pentru producerea de vaccinuri. Vaccinul antipolio a fost unul dintre primele medicamente care au fost produse în masă folosind tehnologia culturii celulare. În 1954, Enders , Weller și Robbins au primit Premiul Nobel „pentru descoperirea capacității virusului poliomielitei de a crește în culturi de diferite țesuturi”. În 1952, a fost dezvoltată binecunoscuta linie de celule canceroase umane HeLa .

Principii de bază ale cultivării

Izolarea celulelor

Pentru cultivarea în afara corpului, celulele vii pot fi obținute în mai multe moduri. Celulele pot fi izolate din sânge, dar numai leucocitele pot crește în cultură. Celulele mononucleare pot fi izolate din țesuturile moi folosind enzime precum colagenaza , tripsina , pronaza care distrug matricea extracelulară [3] . În plus, bucăți de țesuturi și materiale pot fi plasate în mediul nutritiv.

Culturile celulare preluate direct din obiect ( ex vivo ) sunt numite primare [4] . Majoritatea celulelor primare, cu excepția celulelor tumorale, au o durată de viață limitată. După un anumit număr de diviziuni, astfel de celule îmbătrânesc și nu se mai divizează, deși pot rămâne viabile.

Există linii celulare imortalizate ("nemuritoare") care se pot reproduce la infinit. În majoritatea celulelor tumorale, această capacitate este rezultatul unei mutații aleatorii , dar în unele linii celulare de laborator este dobândită artificial, prin activarea genei telomerazei [5] [6] .

Cultura celulară

Celulele sunt crescute în medii nutritive speciale la o temperatură constantă. Pentru culturile de celule vegetale se folosește iluminare controlată, iar pentru celulele de mamifere este de obicei necesar și un mediu gazos special, menținut într-un incubator de culturi celulare [7] [8] . De regulă, concentrația de dioxid de carbon și vapori de apă în aer este reglată, dar uneori și oxigen. Mediile nutritive pentru diferite culturi celulare diferă în ceea ce privește compoziția, pH -ul, concentrația de glucoză , compoziția factorilor de creștere etc. [9] . Factorii de creștere utilizați în mediile de cultură de celule de mamifere sunt cel mai frecvent adăugați împreună cu serul de sânge . Unul dintre factorii de risc în acest caz este posibilitatea de infectare a culturii celulare cu prioni sau viruși. În cultură, una dintre sarcinile importante este evitarea sau reducerea la minimum a utilizării ingredientelor contaminate. Cu toate acestea, în practică, acest lucru nu este întotdeauna realizat. Cea mai bună, dar și cea mai scumpă modalitate este să adăugați factori de creștere purificați în loc de ser [10] .

Celulele pot fi crescute în suspensie sau în stare adeziv . Unele celule (cum ar fi celulele sanguine ) există în mod natural în suspensie. Există, de asemenea, linii celulare modificate artificial, astfel încât acestea să nu adere la suprafețe; aceasta se face pentru a crește densitatea celulelor în cultură. Creșterea celulelor aderente necesită o suprafață, cum ar fi cultura de țesut, sau un material plastic acoperit cu elemente de matrice extracelulară pentru a îmbunătăți proprietățile adezive, precum și pentru a stimula creșterea și diferențierea. Majoritatea celulelor țesuturilor moi și dure sunt adezive. Din cultura de tip adeziv se disting culturile de celule organotipice, care sunt un mediu tridimensional, spre deosebire de sticla convențională de laborator. Acest sistem de cultură este cel mai asemănător din punct de vedere fizic și biochimic cu țesuturile vii, dar are unele dificultăți tehnice în întreținere (de exemplu, are nevoie de difuzie). Pentru a asigura condițiile fizice necesare pentru cultivarea culturilor adezive și popularea volumului matricei extracelulare a structurilor de inginerie tisulară se folosesc sisteme de cultivare dinamică [11] bazate pe bioreactoare rotative și vortex, bioreactoare cu contact direct cu schela: bioreactoare de compresie. , bioreactoare cu tensiune mecanică și presiune hidrostatică, bioreactoare speciale pentru stimularea electrică a celulelor și țesuturilor, precum și bioreactoare combinate [12] .

Contaminarea încrucișată a liniilor celulare

Când lucrează cu culturi celulare, oamenii de știință se pot confrunta cu problema contaminării încrucișate.

Caracteristicile celulelor în creștere

La creșterea celulelor, din cauza diviziunii constante, poate apărea supraabundența lor în cultură și, ca urmare, apar următoarele probleme:

Pentru a menține funcționarea normală a culturilor de celule, precum și pentru a preveni fenomenele negative, mediul nutritiv este înlocuit periodic, celulele sunt trecute și transfectate . Pentru a evita contaminarea culturilor cu bacterii, drojdii sau alte linii celulare, toate manipulările sunt de obicei efectuate în condiții aseptice într-o cutie sterilă. Antibioticele ( penicilina , streptomicina ) si antifungicele ( amfotericina B ) pot fi adaugate in mediul de cultura pentru a suprima microflora .

Unul dintre produsele metabolismului în celule sunt acizii, în urma cărora pH -ul mediului scade treptat. Pentru a controla aciditatea mediilor nutritive, acestora li se adaugă indicatori de pH .

Dacă cultura celulară este aderentă, mediul nutritiv poate fi înlocuit complet.

Trecerea celulelor

Trecerea (separarea) celulelor  este selectarea unui număr mic de celule pentru creștere într-un alt vas de laborator. Dacă cultura crește rapid, acest lucru trebuie făcut în mod regulat, deoarece substanțele nutritive sunt epuizate în mediu și se acumulează produse metabolice . Culturile în suspensie sunt mai ușor de trecut, deoarece este suficient doar să selectați numărul necesar de celule, să le plasați în alte vase și să adăugați mediu nutritiv proaspăt. Celulele adezive trebuie separate de substrat înainte de aceasta și grupurile lor trebuie separate. Cel mai adesea, un amestec de tripsină și EDTA sau alte amestecuri de enzime este utilizat în acest scop , uneori este suficient doar EDTA în soluție salină fiziologică (soluția Versen). Dacă cultura crește lent, de obicei este hrănită fără a fi transferată într-un alt vas, periodic (de obicei o dată la 2-3 zile) luând o parte din mediul folosit și adăugând proaspăt.

Transfectare și transducție

ADN-ul străin poate fi introdus în celule în timpul cultivării lor prin transfecție (metodă non-virală). Această tehnologie este adesea folosită pentru expresia controlată a genelor . Relativ recent, transfecția ARNm a fost implementată cu succes în aceste scopuri .

ADN-ul poate fi introdus și în genomul celulei de către viruși sau bacteriofagi . Ei, fiind paraziți intracelulari, sunt cei mai potriviți pentru aceste scopuri, deoarece introducerea materialului genetic în celula gazdă este o parte normală a ciclului lor de viață [13] . Această metodă se numește transducție .

Liniile celulare umane

Cultivarea celulelor umane este oarecum împotriva regulilor bioeticii , deoarece celulele crescute izolat pot supraviețui organismului părinte și apoi pot fi folosite pentru a efectua experimente sau pentru a dezvolta noi tratamente și a profita de pe urma acestuia. Prima decizie judecătorească în acest domeniu a fost pronunțată de Curtea Supremă din California în cauza John Moore v. University of California , conform căreia pacienții nu au niciun drept de proprietate asupra liniilor celulare obținute din organe prelevate cu consimțământul lor [14] .

Hibridom

Un hibridom  este o linie celulară rezultată din fuziunea limfocitelor normale cu celulele canceroase „nemuritoare”. Folosit pentru a produce anticorpi monoclonali . Leucocitele izolate din splina sau din sângele animalelor imunizate produc anticorpi cu specificitatea necesară, dar ca și în cazul oricărei culturi primare, capacitatea lor de a prolifera este limitată de limita Hayflick . Pentru imortalizare, ele sunt fuzionate artificial cu o linie celulară de mielom „nemuritoare” , rezultând o recombinare a trăsăturilor. După aceea, linia este donată și sunt selectate clonele care sunt capabile simultan de proliferare nelimitată și de a produce anticorpi împotriva antigenului selectat .

Utilizarea culturilor celulare

Cultura de celule în masă este baza pentru producția industrială de vaccinuri virale și o varietate de produse biotehnologice .

Produse biotehnologice

O metodă industrială din culturi celulare produce produse precum enzime , hormoni sintetici , anticorpi monoclonali , interleukine , limfokine , medicamente antitumorale . Deși multe proteine ​​simple pot fi obținute relativ ușor folosind ADNr în culturi bacteriene, proteine ​​mai complexe, cum ar fi glicoproteinele, pot fi obținute în prezent numai din celule animale. Una dintre aceste proteine ​​importante este hormonul eritropoietina . Costul creșterii culturilor de celule de mamifere este destul de mare, așa că în prezent se fac cercetări cu privire la posibilitatea de a produce proteine ​​complexe în culturi de celule de insecte sau plante superioare .

Culturi de țesuturi

Cultura celulară este o parte integrantă a tehnologiei culturii de țesuturi și a ingineriei țesuturilor, deoarece definește baza pentru creșterea celulelor și menținerea acestora într-o stare viabilă ex vivo .

Vaccinuri

Folosind tehnici de cultură celulară, în prezent sunt produse vaccinuri împotriva poliomielitei , rujeolei , oreionului , rubeolei și varicelei . Din cauza amenințării unei pandemii de gripă cauzată de tulpina H5N1 a virusului, guvernul Statelor Unite finanțează în prezent cercetarea unui vaccin împotriva gripei aviare folosind culturi celulare.

Culturi de celule non-mamifere

Culturi de celule vegetale

Culturile de celule vegetale sunt de obicei crescute fie ca suspensie într-un mediu nutritiv lichid, fie ca cultură de calus pe o bază nutritivă solidă. Cultivarea celulelor nediferențiate și a calusului necesită menținerea unui anumit echilibru al hormonilor de creștere a plantelor auxine și citokinine .

Culturi bacteriene, de drojdie

Pentru cultivarea unui număr mic de celule bacteriene și de drojdie , celulele sunt placate pe un mediu nutritiv solid pe bază de gelatină sau agar-agar . Pentru producția de masă, se folosește cultivarea în medii nutritive lichide (bulion).

Culturi virale

Culturile de virus sunt cultivate în culturi de celule de mamifere , plante , fungi sau bacterii , în funcție de gazda naturală a tipului particular de virus . Dar, în anumite condiții, ele pot fi cultivate în celule de alt tip.

În acest caz, cultura celulară în sine servește ca mediu pentru creșterea și replicarea virusului.

Tipuri de linii celulare

Lista scurtă de linii celulare

Lista celor mai comune linii celulare prezentată aici nu este deloc exhaustivă.

linie celulara Explicația abrevierei organism Textile Morfologie Note și link-uri
293-T uman rinichi (embrionar) Derivat din HEK-293 ECACC
celule 3T3 „Transfer de 3 zile, inocul 3 x 105 celule” mouse fibroblaste embrionare Cunoscut și ca NIH 3T3 CLS ECACC
721 uman melanom
9L şobolan glioblastom
A2780 uman ovar cancer ovarian ECACC
A2780ADR uman ovar derivat al A2780 cu rezistență la adriamicină ECACC
A2780cis uman ovar derivat rezistent la cisplatină al A2780 ECACC
A172 uman glioblastom gliom malign CLS ECACC
A431 uman epiteliul pielii carcinom cu celule scuamoase Baza de date pentru liniile celulare CLS ECACC
A-549 uman carcinom pulmonar epiteliu CLS DSMZ ECACC
B35 şobolan neuroblastom ATCC  (link indisponibil)
BCP-1 uman leucocite periferice limfom HIV+ ATCC
BEAS-2B epiteliu bronșic + hibrid de virus adenovirus 12-SV40 (Ad12SV40) uman plămânii epiteliu ATCC  (link indisponibil)
îndoire.3 endotelial cerebral mouse cortexul endoteliu ATCC
BHK-21 „Rinichi de pui de hamster” hamster mugur fibroblaste CLS ECACC Olympus Arhivat pe 27 decembrie 2009 la Wayback Machine
BR 293 uman sanului rac de râu
BxPC3 Biopsie xenografică a carcinomului pancreatic linia 3 uman adenocarcinom pancreatic epiteliu ATCC  (link indisponibil)
C3H-10T1/2 mouse celule mezenchimatoase embrionare ECACC
C6/36 Aedes albopictus (țânțar) țesut larvar ECACC
CHO Ovar de hamster chinezesc Hamster cenușiu (Cricetulus griseus) ovar epiteliu CLS ECACC ICLC  (link indisponibil)
COR-L23 uman plămânii ECACC
COR-L23/CPR uman plămânii ECACC
COR-L23/5010 uman plămânii ECACC
COR-L23/R23 uman plămânii epiteliu ECACC
COS-7 Cercopithecus aethiops, origine-defect SV-40 maimuță Cercopithecus aethiops mugur fibroblaste CLS ECACC ATCC
CML T1 Leucemie mielodă cronică limfocitul T 1 uman leucemie mieloidă cronică leucemie cu celule T Sânge
CMT tumoră mamară canină câine sanului epiteliu
D17 câine osteosarcom ECACC
DH82 câine histiocitoză monocite/macrofage ECACC

J Vir Meth

DU145 uman carcinom prostata CLS
DuCaP Dura mater Cancer de prostată uman cancer de prostată metastatic epiteliu 11317521
EL4 mouse leucemie cu celule T ECACC
EMT6/AR1 mouse sanului epiteliu ECACC
EMT6/AR10.0 mouse sanului epiteliu ECACC
FM3 uman metastaze la un ganglion limfatic melanom
H1299 uman plămânii rac de râu
H69 uman plămânii ECACC
HB54 hibridom hibridom secretă MA2.1 mAb (împotriva HLA-A2 și HLA-B17) Jurnal de Imunologie
HB55 hibridom hibridom secretă mAb L243 (împotriva HLA-DR) Imunologie umană
HCA2 uman fibroblaste Jurnalul de Virologie Generală
HEK-293 rinichiul embrionar uman uman rinichi (embrionar) epiteliu CLS ATCC
HeLa Henrietta Lacks uman cancer cervical epiteliu CLS DSMZ ECACC
Hepa1c1c7 clona 7 a clonei 1 linia 1 de hepatom mouse hepatom epiteliu ECACC

ATCC  (link indisponibil)

HL-60 leucemie umană uman mieloblaste celule de sânge CLS ECACC DSMZ
HMEC celula epitelială mamară umană uman epiteliu ECACC
HT-29 uman epiteliul colonic adenocarcinom HT-29 ECACC

Baza de date celulară

Jurkat uman leucemie cu celule T celule albe ECACC

DSMZ

JY uman limfoblaste Celulele B imortalizate de EBV
K562 uman limfoblaste leucemie mieloidă cronică CLS ECACC
Ku812 uman limfoblaste eritroleucemie ECACC

Standardele LGC

KCL22 uman limfoblaste leucemie mieloidă cronică
KYO1 Kyoto 1 uman limfoblaste leucemie mieloidă cronică DSMZ
LNCap Cancerul ganglionilor limfatici de prostată uman adenocarcinom de prostată epiteliu CLS ECACC ATCC  (link indisponibil)
Ma-Mel 1, 2, 3….48 uman linii celulare de melanom
MC-38 mouse adenocarcinom
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 uman sanului carcinom ductal invaziv al sânului ER+, PR+ CLS
MCF-10A Fundația de Cancer din Michigan uman sanului epiteliu ATCC
MDA-MB-231 MD Anderson-Sân metastatic uman sanului rac de râu ECACC
MDA-MB-468 MD Anderson-Sân metastatic uman sanului rac de râu ECACC
MDA-MB-435 MD Anderson-Sân metastatic uman sanului melanom sau carcinom (fără consens) Cambridge Pathology ECACC
MDCK II Madin Darby rinichi canin câine mugur epiteliu CLS ECACC ATCC
MOR/0,2R uman plămânii ECACC
NCI-H69/CPR uman plămânii ECACC
NCI-H69/LX10 uman plămânii ECACC
NCI-H69/LX20 uman plămânii ECACC
NCI-H69/LX4 uman plămânii ECACC
NIH-3T3 National Institutes of Health, transfer de 3 zile, inocul 3 x 10 5 celule mouse embrion fibroblaste CLS ECACC ATCC
NALM-1 sânge periferic leucemie mieloidă cronică Genetica si citogenetica cancerului
NW-145 melanom ESTDAB Arhivat pe 16 noiembrie 2011 la Wayback Machine
OPCN/OPCT Onyvax [1] Cancer de prostată…. uman linii celulare de cancer de prostată Asterand Arhivat pe 7 iulie 2011 la Wayback Machine
egal uman leucemie cu celule T DSMZ
PNT-1A / PNT 2 linii celulare de cancer de prostată ECACC
RenCa Carcinom renal mouse carcinom renal CLS
RIN-5F mouse pancreas
RMA/RMAS mouse Cancerul cu celule T
Saos-2 uman osteoxarcom CLS ECACC
Sf-9 Spodoptera frugiperda fluture Spodoptera frugiperda ovar CLS DSMZ ECACC
SkBr3 uman carcinom mamar CLS
T2 uman hibridom de celule B și leucemie cu celule T DSMZ
T-47D uman sanului carcinom de canal CLS
T84 uman carcinom de colon/ metastaze pulmonare epiteliu [2] ECACC ATCC
THP1 uman monocite leucemie mieloidă acută CLS ECACC
U373 uman glioblastom-astrocitom epiteliu
U87 uman glioblastom-astrocitom epiteliu CLS Abcam
U937 uman limfom monocitar leucemic CLS ECACC
VCaP Vertebra Cancer de prostată uman cancer de prostată metastatic epiteliu ECACC ATCC Arhivat 19 februarie 2012 la Wayback Machine
Vero „Vera Reno” („boboc verde”) / „Vero” („adevărat”) Maimuță verde africană epiteliul renal CLS ECACC
WM39 uman Piele melanom primar
WT-49 uman limfoblaste
X63 mouse melanom
YAC-1 mouse limfom Baza de date pentru linii celulare CLS ECACC
YAR uman limfocitele B EBV transformat [3] Human Immunology Arhivat 20 septembrie 2008 la Wayback Machine

Vezi și

Note

  1. ↑ Soluția lui Ringer
  2. ↑ Copie arhivată (link nu este disponibil) . Consultat la 24 martie 2009. Arhivat din original la 1 septembrie 2006. 
  3. ↑ Celulele pot fi izolate din țesuturi și împărțite în diferite tipuri (link inaccesibil) . Data accesului: 24 martie 2009. Arhivat din original pe 26 mai 2009. 
  4. ↑ Laborator. Cultivarea celulelor și țesuturilor . www.primer.ru (2003). Consultat la 27 martie 2010. Arhivat din original pe 10 mai 2003.
  5. ↑ Telomeraza . Dark Matter (15 septembrie 2006). Preluat: 27 martie 2010.
  6. ↑ Maqsood MI, Matin MM, Bahrami AR, Ghasroldasht MM (2013). Nemurirea liniilor celulare: provocări și avantaje ale stabilirii. Biologie celulară internațională. 37(10), 1038–1045. doi : 10.1002/cbin.10137 PMID 23723166
  7. ↑ Incubatoare Binder CO2 (Germania) . Serviciu tehnic . Consultat la 27 martie 2010. Arhivat din original la 19 noiembrie 2012.
  8. ↑ Echipamente de laborator și consumabile. Incubatoare (2007). Preluat la 27 martie 2010. Arhivat din original la 8 iunie 2012.
  9. ↑ Cu ajutorul mediilor cu o anumită compoziție chimică pot fi identificați factori de creștere specifici (link inaccesibil) . Preluat la 24 martie 2009. Arhivat din original la 10 noiembrie 2007. 
  10. ↑ LipiMAX soluție purificată de lipoproteine ​​din ser bovin . Serviciile biologice Selborne (2006). Preluat la 27 martie 2010. Arhivat din original la 8 iunie 2012.
  11. ↑ Lundup A.V., Demchenko A.G., Tenchurin T.Kh., Krasheninnikov M.E., Klabukov I.D., Shepelev A.D., Mamagulashvili V.G., Oganesyan R.V., Orekhov A.S., Chvalun S.N., Dyheva Îmbunătățirea eficienței colonizării matricelor biodegradabile de către celulele stromale și epiteliale în timpul cultivării dinamice  // Genes and Cells. - 2016. - T. 11 , Nr. 3 . - S. 102-107 . — ISSN 2313-1829 .
  12. ↑ Guller A.E., Grebenyuk P.N., Shekhter A.B., Zvyagin A.V., Deev S.M. Ingineria tisulară a tumorilor folosind tehnologii de bioreactor  // Acta Naturae (versiunea rusă). - 2016. - T. 8 , Nr. 3 . - S. 49-65 . — ISSN 2075-8243 .
  13. ↑ Mecanismul de infectare cu virus
  14. ↑ V. Bogomolova. Cine deține corpul nostru? . Arcanus (3 august 2009). Consultat la 27 martie 2010. Arhivat din original pe 5 martie 2016.

Link -uri

  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii
În cataloagele bibliografice