Open chromatin ( în engleză open chromatin ) - zone mici de cromatina , lipsite de nucleozomi [1] . Plantarea nucleozomilor este în general împiedicată de factorii proteici asociați cromatinei care recunosc anumite secvențe ADN . Aceste proteine includ factori de transcripție , ADN sau ARN polimeraze . Cromatina deschisă coincide adesea cu secvențele cis-regulatoare și anume: promotori , amplificatori , izolatori , amortizoare, locurile de început ale replicării ADN [2] . Dimensiunea secțiunilor deschise ale cromatinei este de obicei de câteva sute de perechi de baze , cu o medie de aproximativ 300 bp [3] .
Cromatina deschisă este determinată cel mai adesea folosind metoda sensibilității la DNază. Regiunile fără nucleozomi ale cromatinei sunt atacate de preferință de DNaza I atunci când celulele permeabilizate sau nucleele izolate sunt tratate cu aceasta . În acest sens, cromatina deschisă este adesea denumită situsuri hipersensibile la DNaza I sau situsuri hipersensibile . Probabilitatea clivajului ADN-ului de către nuclează în situsurile hipersensibile poate depăși media de sute și chiar de mii de ori. Hipersensibilitatea la cromatină DNaza I deschisă ar trebui să fie distinsă de sensibilitatea generală crescută la DNază a genelor transcrise activ [4] .
În funcție de tipul de factori proteici a căror legare la ADN împiedică aterizarea nucleozomilor, regiunile cromatinei hipersensibile la DNaza I pot fi specifice țesuturilor sau constitutive, adică prezente în celulele diferențiate pe diferite căi.
Pentru a mapa zonele de cromatina deschisă, se utilizează sensibilitatea la DNază ( hipersensibil la DNaza I ) și izolarea elementelor de reglare folosind formaldehidă . izolarea asistată de formaldehidă a elementelor de reglementare (FAIRE) [1] . Metoda de sensibilitate la DNază nu permite să se determine care loc de reglementare este această zonă a cromatinei deschise [1] .
Anterior, analiza rezultatelor metodei de sensibilitate la DNază a fost efectuată utilizând hibridizarea Southern blot ( eng. Southern blot ). Acest lucru nu ne-a permis să analizăm un număr mare de site-uri, precum și să găsim noi site-uri de hipersensibilitate. Analiza sensibilității ADNază poate fi efectuată și folosind PCR în timp real (PCR cantitativ). Aceasta este mult mai simplă decât hibridizarea Southern blot, dar această metodă are, de asemenea, un număr limitat de situsuri pentru analiză și nu poate fi utilizată pentru un studiu la nivelul genomului al distribuției situsurilor de sensibilitate la DNaza I [5] .
Dezvoltarea metodelor de secvențiere cu randament ridicat și a metodelor ADN- microarray face posibilă cartografierea regiunilor deschise de cromatina în întregul genom [ 6 ] . În plus, combinația metodei de sensibilitate la DNază cu metoda de imunoprecipitare a cromatinei ( ChIP) , urmată de secvențierea cu randament ridicat oferă mai multe informații despre legarea factorilor de transcripție specifici la situsurile cromatinei active [1] .
Un alt mod de a mapa zonele de cromatina deschisă este de a efectua imunoprecipitarea cromatinei ( ChIP ) pentru anticorpii la histone . În același timp, regiunile cromatinei deschise ar trebui să fie slab reprezentate, deoarece nucleozomii nu sunt asociați cu acestea. Metoda sensibilității la DNază și imunoprecipitarea histonelor dau rezultate similare [7] .
În genomii eucarioți , secvențele necodificante implicate în reglarea expresiei genelor în diferite stadii de dezvoltare a unui organism sau în diferite țesuturi sunt de o importanță deosebită. Descoperirea și caracterizarea regiunilor de reglare devine esențială pentru înțelegerea tiparelor în expresia genelor [5] . Deci, în genomul uman, mai mult de 95% din ADN este necodificator . Această clasă de secvențe, pe lângă ADN nedorit , include secvențe de reglare importante: promotori, amplificatori, amortizoare, izolatori sau loci de control ( regiuni de control al locusului (LCR) ) . Consorțiul ENCODE a arătat că situsurile de hipersensibilitate la DNaza I identificate în 1% din genomul uman sunt markeri ai modificărilor histonelor , situsuri de replicare timpurie , situsuri de pornire a transcripției și situsuri de legare a factorului de transcripție [8] . De asemenea, cromatina deschisă este adesea asociată cu ARN-uri necodante transcrise în mod activ [8] .
În plus față de secvențele regulatoare necodante, cromatina deschisă este, de asemenea, asociată cu exonii și intronii genelor transcrise activ. Mai ales adesea astfel de zone de cromatina deschisă coincid cu primul exon și intron al genei [5] . Cu toate acestea, prezența cromatinei deschise nu este o condiție suficientă pentru activitatea genei. Genele netranscrise asociate cu cromatina deschisă sunt într-o stare de „pregătire” pentru transcripție (în engleză , starea echilibrată ) [5] . Astfel, formarea cromatinei deschise sau trecerea la o stare inactivă este importantă pentru reglarea expresiei genelor.
Nu numai locurile de legare ale factorilor de transcripție și ale altor proteine de reglare pot fi libere de nucleozomi. Unele secvențe de ADN nu se pot înfășura în jurul globulelor nucleozomale. Acestea sunt secvențe care au flexibilitate redusă și secvențe care tind să creeze structuri non-canonice, cum ar fi ac de păr [9] .
Captura de ecran UCSC Browser arată colocalizarea unui site Clustere de hipersensibilitate DNaseI cu promotorii a două gene. Zonele de cromatina deschisă sunt înconjurate de histone H3 [ acetilate la al 27-lea reziduu de lizină ( H3K27Ac), care este o etichetă pentru regiunile active de reglare a cromatinei, cum ar fi promotorii și amplificatorii. În plus, în regiunea situsului de hipersensibilitate la DNază, există un situs de legare pentru mulți factori de transcripție, printre care se poate găsi factorul conservat de inițiere a transcripției TBP (este partea principală a TFIID ). De asemenea, puteți observa legarea frecventă în această regiune a ARN polimerazei II , care realizează transcripția genelor care codifică proteine la oameni . Acest loc de hipersensibilitate la DNază se caracterizează prin conservatorism crescut în rândul mamiferelor ( Eng. Mammal Cons ), ceea ce înseamnă că această secvență este păstrată în timpul evoluției și, ca urmare, semnificația sa funcțională [8] .
Formarea regiunilor libere de nucleozomi are loc sub acțiunea unor factori speciali care realizează asamblarea, dezasamblarea și mișcarea nucleozomilor. Procesul de schimbare a poziției nucleozomilor se numește remodelare a cromatinei . Aceasta implică complexe de remodelare a cromatinei - complexe de proteine conservatoare care lucrează cu consumul de energie al ATP . Remodelarea cromatinei se realizează după introducerea anumitor mărci epigenetice - modificarea histonelor sau metilarea ADN-ului . Dacă semnele corespund cromatinei active (de exemplu, a 9-a lizină acetilată a histonei H3, a 4-a lizină di- și trimetilată a histonei H3 și multe altele), atunci se formează zone de cromatină deschisă. Adesea, profilul modificărilor histonelor are o distribuție definită în jurul situsului de hipersensibilitate la DNaza I [5] .
Metodele extrem de eficiente fac posibilă compararea distribuției regiunilor cromatinei deschise în diferite țesuturi sau culturi celulare din același organism. O astfel de comparație relevă o diferență semnificativă în distribuția unor astfel de regiuni în genom [5] . Aceasta indică o activitate diferită a unor astfel de locuri în diferite țesuturi. Astfel, promotorul și amplificatorul unei gene pot fi localizate în regiunea deschisă a cromatinei într-un țesut și pot fi închise de nucleozomi în altul. Aceasta indică o expresie diferită a genelor în diferite țesuturi și este cea mai caracteristică genelor specifice țesuturilor . În schimb, genele găsite în regiunea deschisă a cromatinei în toate țesuturile și liniile celulare sunt de obicei denumite gene menajere . Profilul sensibilității la DNază se poate modifica și în timpul dezvoltării și diferențierii celulelor. Pentru a identifica activitatea genelor specifice țesutului, utilizați definiția ontologiei genelor ( ing. Gene Ontology (GO) ) după efectuarea DNase-seq [5] .