Secvențierea polonică ( ing. colonie de polimerază - „colonia de polimerază”) este o tehnologie de secvențiere de nouă generație (NGS) fără separare electroforetică , care permite citirea a milioane de secvențe scurte de ADN imobilizate , mult mai ieftină în comparație cu secvențierea Sanger .
Tehnologia a fost dezvoltată în laboratorul Dr. George McDonald Church de la Harvard (Harvard Medical School). În comparație cu alte tehnici de secvențiere, secvențierea polonică este efectuată pe o platformă și protocoale open source. Platforma hardware a acestei metode poate fi combinată cu ușurință cu microscopie epifluorescență disponibilă pe scară largă și sisteme microfluidice controlate de computer .
Ideea principală a metodei este generarea unui număr mare de „poloni” unice (colonii moleculare generate de polimerază), care sunt secvențiate într-o ordine aleatorie. Secvențierea poloniei este efectuată pentru o bibliotecă de etichete de capăt perechi (etichete de capăt perechi ): fiecare moleculă de ADN are o lungime de 135 bp. ( perechi de baze ), conține două etichete lungi de 17-18 bp, separate și flancate de o secvență comună. Lungimea curentă de citire pentru această tehnică este de 26 bp. pentru amplicon și 13 p. pentru o etichetă (pe fiecare etichetă rămâne un interval necitit de 4-5 bp).
Există trei pași principali în protocolul de secvențiere a polonicului:
Protocolul începe cu fragmentarea ADN-ului genomic studiat în secvențe scurte (aproximativ egale ca lungime). Fragmentele scurte rezultate sunt supuse reparării finale și procesării finale cu adenină (adăugând adenină la capătul 3' al ADN-ului fragmentat). Reparația terminală transformă orice capăt de ADN deteriorat sau în supraînălțare în capete tocite 5’-fosforilate, permițând astfel ligarea imediată a capătului tocit . Folosind 6% TBE PAAG, sunt selectate fragmente de ADN de ~1000 bp. În etapa următoare, moleculele de ADN sunt transformate într-o formă circulară cu oligonucleotide sintetice T-terminale lungi de 30 bp. (T30). T30 conține două site-uri pentru MmeI. ADN-ul circular rezultat se repetă într-un inel rulant . Moleculele de ADN circulare amplificate sunt procesate de enzima de restricție MmeI ( endonucleaza de restricție de tip II ), care taie la distanță de locul său de recunoaștere. Ca rezultat al restricției , se formează fragmente T30, flancate pe ambele părți de etichete de 17-18 bp. fiecare (lungimea totală a fragmentului este deci ~70 bp). Moleculele obținute cu etichete de capăt împerecheate trebuie reparate înainte de legarea cu primeri (FDV2 și RDV2) la capetele lor pentru PCR în emulsie (ePCR). Componentele bibliotecii sunt molecule de ADN lungi de 135 bp. sunt selectate pentru dimensiune și supuse nick-broadcasting . Etapa finală a construcției bibliotecii este amplificarea PCR pentru a crește cantitatea de material de bibliotecă și a elimina produsele străine ale reacției de ligatură. Șabloanele ADN rezultate includ secvența FDV (44 bp), eticheta proximală (17-18 bp), T30 (30 bp), eticheta distală (17-18 bp) și secvența RDV (25 bp).
Pasul cel mai critic în proiectarea unei biblioteci de etichete finale este formarea de molecule circulare de ADN genomic în jurul unui linker sintetic. Această etapă este limitarea ratei pentru întreaga etapă.
Granule paramagnetice de dimensiuni uniforme acoperite cu streptavidină și purtând primeri înainte biotinilați . Streptavidina are o afinitate foarte puternică pentru biotină, astfel încât grundul este foarte puternic legat de suprafața mărgelei. Faza apoasă a reacției conține perle paramagnetice, un amestec de componente PCR, primeri direct și invers și o bibliotecă de etichete finale pereche. Faza apoasă este amestecată şi agitată cu faza uleioasă pentru a forma o emulsie . Într-o situație ideală, fiecare picătură de apă dintr-o emulsie de ulei va conține o sferă și o moleculă șablon de ADN, ceea ce permite ca milioane de reacții de amplificare PCR care nu interacționează să fie efectuate într-un volum de mililitru.
Ruperea emulsieiDupă amplificare, emulsia obținută în etapa anterioară este spartă prin tratare cu izopropanol și o soluție tampon cu detergent (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% (v/v) Triton X-100 , 1% (greutate/ob) SDS) și agitare ulterioară, centrifugare și separare magnetică . Soluția rezultată este o suspensie cu perle goale, clonale și non-clonale, care au fost obținute din picături de emulsie fără matriță ADN, cu un singur matriță ADN, sau, respectiv, cu mai multe matrițe ADN. Îmbogățirea cu margele cu produse amplificate se realizează în pasul următor.
Îmbogățirea fracției cu bile cu ampliconiÎmbogățirea cu mărgele de produs amplificat se realizează prin hibridizare cu margele mai mari, nemagnetice , de polistiren de joasă densitate . Granulele de polistiren poartă oligonucleotide captivante biotinilate (secvențe de ADN complementare secvențelor amplificate ePCR). Amestecul este centrifugat pentru a separa complexele rezultate (microbille cu ampliconi și bile capcane) de microbilele care nu poartă ampliconi. Complexele detașate au o densitate mai mică și rămân în supernatant , în timp ce microbilele fără ampliconi formează un precipitat. Supernatantul este separat și tratat cu alcali ( NaOH ) pentru a rupe complecșii. Bilele de amplicon paramagnetic sunt separate de margele de capcană nemagnetice prin separare magnetică . Acest protocol permite o îmbogățire de cinci ori cu margele care poartă secvențe amplificate.
Capsul baloanelorAtașarea unei oligonucleotide de acoperire la capetele 3’ ale primerilor direct și segmentul RDV al ADN-ului șablon. Capacul conține o grupare de aminoacizi care împiedică legarea sondei fluorescente la secvența acoperită, în timp ce în același timp capacul facilitează interacțiunea secvenței cu suprafața aminozilata a celulei de flux.
Microcip pe lamelăLamelele sunt spălate și tratate cu aminosilan . Acest tratament promovează formarea de legături covalente cu ADN-ul șablon și eliminarea contaminării cu sonde fluorescente. O fracțiune de microbile cu ampliconi se amestecă cu acrilamidă și se toarnă într-o mică adâncime pe o lamă de sticlă acoperită cu teflon . Lama cu gel de acrilamidă este imediat acoperită cu o lamela tratată cu aminosilan . Timpul de polimerizare este de 45 de minute. Lama de acoperire și lama sunt apoi răsturnate și lama este îndepărtată. Lama tratată cu silan se leagă covalent de gel, în timp ce teflonul de pe suprafața lamei asigură o separare mai bună de gelul de acrilamidă. Lamela este apoi atașată de corpul celulei de flux și orice microbile nelegate sunt îndepărtate.
Baza biochimică a secvențierii polonică este proprietățile discriminatorii ale ligazelor și polimerazelor . În primul rând, o serie de primeri de ancorare sunt pompați prin godeu, primerii hibridând la secvențe de oligonucleotide sintetice direct la capetele 3’ sau 5’ ale etichetelor distale sau proximale (17-18 bp lungime) ale ADN-ului genomic. Apoi, primerul de ancorare este ligat cu nonameri degenerați (oligonucleotide 9 nt) marcați cu etichete fluorescente.
Nonamerii purtători de fluorofori se recoace cu succes variabil pentru a marca secvențele într-o manieră care amintește de utilizarea primerilor degenerați. Cu toate acestea, în loc să fie prezentați polimerazei , nonamerii sunt legați selectiv la ADN-ul primerului de ancorare adiacent. Fixarea unei molecule de fluorofor oferă un semnal de fluorescență care permite discriminarea între atașarea A, C, G sau T la poziția de interes din eticheta ADN-ului genomic. După obținerea imaginilor în patru culori, complexele dintre primerii de ancorare cu oligonucleotidele nomerice sunt spălate și începe un nou ciclu datorită înlocuirii primerilor de ancorare. Este introdus un nou amestec de nonameri marcați fluorescent, pentru care poziția care trebuie determinată este deplasată cu 1 pas de-a lungul etichetei genomice.
Această tehnică vă permite să cunoașteți succesiunea a 7 baze în direcția de la capătul 5’ la capătul 3’ și a 6 baze de la capătul 3’. Rezultatul final este o citire de 26 de baze (13 de la fiecare etichetă finală) cu un spațiu de 4-5 baze în mijlocul fiecărei etichete.
Construcția bibliotecii de etichete de final durează aproximativ o săptămână dacă ciclurile lungi de incubare se fac peste noapte. Protocolul poate fi oprit după cum este necesar după orice etapă de purificare a produsului. Titrarea concentrației matricei pentru PCR în emulsie durează 2 zile. Emulsie PCR se efectuează în 2 zile. Începutul procesului de secvențiere durează 3 ore, fiecare ciclu următor este de 1,75 ore.Timpul total pentru ciclurile de secvențiere continue este de 49 de ore.
Secvențierea Polony produce milioane de 26 de citiri de bază pe rulare. Aceste informații trebuie să fie normalizate și convertite în secvențe. Prelucrarea se realizează folosind software dezvoltat în Church Lab Arhivat la 17 iulie 2005 la Wayback Machine (Church Lab). Tot software-ul este în domeniul public.
Secvențierea Poloniei face posibilă obținerea de secvențe ADN cu o precizie ridicată și un randament ridicat, folosind un instrument ieftin disponibil pe scară largă. În plus, această tehnologie este foarte flexibilă, ceea ce îi permite să fie utilizată într-o varietate de scopuri, inclusiv secvențierea cromozomilor artificiali bacterieni, resecvențierea genomului bacterian, precum și analiza în serie a expresiei genelor ( SAGE ) și tehnici de coduri de bare ADN. Un avantaj important al secvențierii polonicului este costul său scăzut. Tehnologia de secvențiere a poloniei poate fi implementată folosind un microscop fluorescent disponibil pe scară largă și o celulă de flux controlată de computer. Conform estimărilor pentru 2005, costul setului necesar de echipamente este de aproximativ 130.000 USD. Cu toate acestea, costul poate fi redus la 100.000 USD în viitorul apropiat. Tehnologia de secvențiere Polony este implementată într-un instrument numit Polonator . Costul dispozitivului este de 170.000 USD. Conform calculelor pentru 2005, prețul fiecărei kilobaze de date brute este de 0,11 USD. Fără a lua în considerare costul de construcție al bibliotecii de etichete finale pereche, costul citirii a 1 kilobază poate fi redus la 0,08 USD.
Deși există o cantitate mare de date brute (786 gigabiți), doar un bit din 10.000 conține informații utile. O altă dificultate este că amplificarea neuniformă reduce eficiența secvențierii și este în prezent cea mai mare dificultate pentru această tehnologie.
Secvențierea poloniei este cea mai eficientă în prezența unui genom de referință. Folosit pentru resecvențierea genomului de E. coli cu o precizie >99,9999% și un cost de 9 ori mai mic comparativ cu secvențierea Sanger. Tehnologia de secvențiere Polony este utilizată în platforma SOLiD (Applied Biosystems). PMAGE („polony multiplex analysis of gene expression” - analiza multiplă a expresiei genelor folosind tehnologia polony). Secvențierea polonie este utilizată pentru studii de haplotipare și splicing .
1. Mitra, R.D., J. Shendure, et al. (2003). „Secvențierea fluorescentă in situ pe colonii de polimerază”. Anal Biochem 320(1): 55-65.
2. Shendure, J., GJ Porreca, et al. (2005). „Secvențierea precisă a polonicului multiplex a unui genom bacterian evoluat”. Science 309(5741): 1728-32.
3. Porreca, GJ, Shendure, J., Biserica G.M. (2006). Secvențierea ADN-ului Poloniei. Curr Protoc Mol Biol: Capitolul 7:Unitatea 7.8.
4. Lin B., Wang J., Cheng Y. (2008). Brevete recente și progrese în tehnologiile de secvențiere de generație următoare. Recent Pat Biomed Eng: (1):60-67.