Secvențierea bisulfiților este denumirea generală pentru un grup de metode care vizează studierea modelului de metilare a ADN-ului prin tratarea acestuia cu bisulfit .
Metilarea este prima marcare epigenetică descoperită. Afectează nivelul expresiei genelor prin suprimarea activității transcripționale . În plus, în multe cazuri, metilarea este ereditară [1] [2] , ceea ce adaugă un interes suplimentar studiului său.
Bisulfitul acționează asupra ADN -ului monocatenar , transformând citozina în uracil [3] . Dacă această citozină este metilata, adică o grupare metil este atașată la al cincilea atom de carbon , atunci o astfel de citozină nu suferă transformare. Astfel, bisulfitul modifică secvența ADN în funcție de modelul său de metilare, iar după expunerea la acesta, este posibil să se determine care dinucleotide CpG au fost metilate prin compararea secvenței modificate cu cea originală.
Metodele descrise mai jos folosesc secvențierea regiunilor ADN tratate cu bisulfit pentru a determina modelul de metilare. Există, de asemenea, metode care nu se bazează pe secvențiere, cum ar fi analiza combinată de restricție a bisulfiților ( COBRA ) și imunoprecipitarea ADN-ului metilat ( MeDIP ). Sarcinile studierii modelelor de metilare pot consta atât în studierea metilării unei anumite citozine, cât și în determinarea proporției de citozine metilate într-o anumită regiune ADN, sau chiar în întregul genom în ansamblu. Dintre următoarele metode, unele sunt mai potrivite pentru studiul site-urilor specifice de metilare, în timp ce altele sunt mai potrivite pentru studiul metilării la niveluri mai înalte. În mod ideal, ar trebui determinată metilarea fiecărei alele . Mai multe recenzii [4] [5] [6] [7] [8] sunt dedicate descrierii metodelor de secvențiere a bisulfiților .
Prima metodă de secvențiere a bisulfiților a fost descrisă în 1992 [9] . Pentru a determina modelul de metilare s-a folosit PCR, primerii cărora au fost specifici atât pentru ADN-ul alterat, cât și pentru ADN neschimbat prin bisulfit, adică nu conțineau citozine incluse în dinucleotidele CpG . Pentru primeri, s-au folosit regiuni apropiate de locul de metilare de interes, dar care nu îl conțin. În cazul în care citozina nu a fost metilata, timina ( uracil ) a fost găsită în secvența amplificată, iar adenina a fost găsită în secvența complementară sintetizată . Dacă citozina a fost metilata, atunci a rămas în secvența amplificată, iar guanina a fost sintetizată în secvența complementară . Această metodă necesită foarte multă muncă, deoarece necesită clonarea produselor PCR pentru a obține sensibilitatea necesară. Aceeași problemă poate fi rezolvată folosind PCR imbricat .
În pirosecvențiere, PCR este utilizată cu primeri care amplifică atât ADN-ul alterat, cât și nemodificat cu bisulfit. Raportul dintre numărul de citozine metilate și nemetilate din secvența amplificabilă este determinat de raportul dintre numărul de nucleotide A și G din secvența complementară sintetizată [10] [11] .
O îmbunătățire suplimentară a acestei metode este utilizarea primerilor specifici alelelor cu polimorfisme cu un singur nucleotide , care permit studiul tiparelor de metilare separat în alelele paterne și materne, ceea ce este util în special în studiul imprimării genomice [12] .
Această metodă se bazează pe metoda analizei polimorfismului conform conformației unice ( SSCA ) . SSCA a fost dezvoltat pentru a detecta polimorfismele cu un singur nucleotide (SNP) [13] . Fragmentele de ADN de aceeași lungime, dar secvențe de nucleotide diferite, se mișcă cu viteze diferite în electroforeză . În general, SSCA nu este suficient de sensibil pentru a detecta o singură substituție, dar cu un număr suficient de polimorfisme de dinucleotide CpG nemetilate în ADN tratat cu bisulfit și netratat, va fi suficient ca sensibilitatea metodei să fie suficientă pentru a determina proporția de citozine metilate în regiunea luată în considerare. Această metodă nu permite studierea metilării la un anumit loc, dar oferă o idee despre metilare la nivelul unei anumite regiuni sau chiar a întregului genom.
Metoda de topire cu sensibilitate ridicată (HRM) se bazează pe PCR în timp real [14] . Temperatura crește de la 55 la 95 °C, în urma căreia legăturile complementare dintre lanțuri sunt distruse. Viteza de topire este înregistrată folosind coloranți fluorescenți speciali , iar știind dependența fluorescenței de secvența nucleotidică a lanțurilor, se pot distinge polimorfisme de un singur nucleotide. Metoda nu oferă informații despre exact care dinucleotide CpG au fost metilate și, prin urmare, nu s-au schimbat în timpul tratamentului cu bisulfit, cu toate acestea, oferă informații destul de precise despre cantitatea lor în zona de interes.
Metoda de extensie a primerului cu un singur nucleotide a fost dezvoltată inițial pentru analiza polimorfismelor cu un singur nucleotide [15] . În legătură cu analiza metilării, se utilizează după cum urmează. Pe ADN monocatenar tratat cu bisulfit, primerii sunt recoapți la perechea de baze imediat precedând locul de metilare de interes. Primerul este apoi extins de ADN polimerază folosind dideoxinucleotide care îl termină . Raportul dintre numărul de citozine metilate și nemetilate din secvența inițială este determinat de raportul dintre numărul de extensii de primer cu nucleotide G și , respectiv , A. Raportul dintre numărul de citozine metilate și nemetilate din secvența inițială poate fi determinat în diferite moduri. Se folosesc etichete radioactive sau fluorescente , precum și pirosecvențiere [16] .
În plus, acest lucru se poate face folosind desorbția/ionizarea cu laser asistată de matrice, urmată de utilizarea unui analizor de masă în timp de zbor (MALDI-TOF) sau a cromatografiei lichide de înaltă performanță cu perechi de ioni în fază inversă (IP-RP-). HPLC) [17] .
Metoda se bazează pe utilizarea clivajului specific ARN [18] . Când un promotor de ARN polimerază in vitro este adăugat la primer în PCR , un transcript de ARN al regiunii de interes este sintetizat , după care este scindat de ribonucleaza A. Ribonucleaza A scindează ARN-ul monocatenar în locațiile nucleotidelor C și U. Folosind trifosfații nucleozidici rezistenți la scindare dUTP și dCTP, scindarea specifică poate fi realizată la situsurile C sau Y. Fragmentele de ARN sunt apoi analizate prin MALDI - TOF . Această metodă oferă informații despre metilarea fiecăreia dintre dinucleotidele CpG disponibile și nu doar despre proporția de nucleotide metilate.
Această metodă utilizează primeri care sunt specifici fie numai ADN-ului transformat cu bisulfit, fie numai ADN-ului netransformat [19] . În consecință, doar regiunile care au fost metilate sunt atașate la primii primeri, iar cele care nu au fost metilate sunt atașate la al doilea primer, ceea ce elimină nevoia de secvențiere a regiunilor după amplificare.
ADN-ul amplificat în MSP poate fi analizat în continuare prin diferite alte metode. Metoda MethyLight folosește MSP în timp real bazat pe fluorescență] [20] . Mc-MSP utilizează analiza curbei de topire [21] . Metoda de topire foarte sensibilă le folosește pe ambele și, prin urmare, este suficient de sensibilă pentru a detecta un nivel scăzut de metilare [22] .
Utilizarea micromatricelor ADN face posibilă extinderea metodelor descrise mai sus pentru analiza metilației la nivelul întregului genom [23] . Oligonucleotidele de micromatrice ADN sunt specifice pentru metilare și corespund situsurilor de interes CpG. Unele sunt complementare secvenței modificate cu bisulfit (adică cea în care situsul CpG nu a fost metilat), în timp ce altele nu sunt. Un exemplu de astfel de metodă este testul de metilare Illumina .
Metodele de secvențiere a bisulfiților au o serie de limitări. La mamifere , modificarea ADN-ului 5-hidroximetilcitozină este larg răspândită. Când este tratată cu bisulfit, 5-hidroximetilcitozină este transformată în citozin-5-metilsulfonat, care este identificat ca fiind C prin secvențiere. Astfel, secvențierea bisulfitului nu poate face distincția între 5-hidroximetilcitozină și metilcitozină și, prin urmare, nu poate fi considerată o metodă sensibilă. numai la metilarea ADN-ului. În 2012, a fost dezvoltată o metodă de secvențiere a bisulfiților pentru a face distincția între aceste două modificări [24] .
Deoarece conversia incompletă a bazelor azotate din ADN de către bisulfit, care este posibilă numai în ADN-ul monocatenar, dă rezultate incorecte, este necesară o selecție precisă a condițiilor experimentale ( temperatura , concentrația de sare) pentru a menține ADN-ul într-o stare denaturată [4] . Menținerea unei conformații monocatenar a ADN-ului poate fi facilitată de fixarea acesteia într- un gel de agaroză [25] .
O altă problemă este degradarea ADN-ului atunci când este tratat cu bisulfit. Deoarece bisulfitul acționează numai asupra ADN-ului monocatenar, este necesar să se efectueze reacția în condiții în care ADN-ul ar rămâne monocatenar și să o efectueze pentru un timp suficient pentru conversia reușită. Totuși, astfel de condiții, și anume temperatura ridicată și perioada lungă de incubație, pot duce la degradarea a până la 90% din întregul ADN [26] .