Mutageneză direcționată la loc

Mutageneza direcționată pe situs ( mutageneză direcționată pe situs sau mutageneza direcționată pe oligonucleotide ) este o  tehnică de biologie moleculară care este utilizată pentru a crea modificări specifice și deliberate în secvența ADN , genă și produse genetice. Folosit pentru a investiga structura și activitatea biologică a ADN-ului, ARN -ului și proteinelor și pentru ingineria proteinelor .

Mutageneza dirijată la situs este una dintre cele mai importante metode de laborator pentru introducerea mutațiilor într-o secvență de ADN. Există numeroase modalități de a realiza mutageneza direcționată pe situs, dar din cauza costului în scădere al sintezei oligonucleotidelor , sinteza artificială a genelor este acum uneori folosită ca alternativă la mutageneza dirijată pe situs. Din 2013, dezvoltarea tehnologiei CRISPR / Cas9 bazată pe un sistem antiviral procariot a permis editarea genomului , iar mutageneza poate fi realizată relativ ușor in vivo [1] .

Istorie

Încercările timpurii de mutageneză folosind radiații sau mutageni chimici au fost non-specifice și au dus la mutații aleatorii. Analogii de nucleotide și alte substanțe chimice au fost ulterior utilizați pentru a crea mutații punctiforme localizate, cum ar fi aminopurina , nitrozoguanidina și bisulfitul . Mutageneza dirijată a locului a fost utilizată pentru prima dată în 1974 în laboratorul lui Charles Weissman. A fost utilizat analogul nucleotidic N-4-hidroxicitidină, care induce tranziția de la GC la AT. Aceste metode de mutageneză au fost, totuși, limitate la tipul de mutație și nu au fost la fel de specifice ca metodele ulterioare de mutageneză direcționată.

În 1971, Clyde Hutchison și Marshall Edgell au arătat că este posibil să se producă mutanți cu fragmente mici din fagul φX174 și nucleaze de restricție. Hutchinson a dezvoltat mai târziu o abordare mai flexibilă de mutageneză direcționată pe situs, folosind oligonucleotide într-o metodă de extensie a ADN-polimerazei împreună cu colaboratorul său Michael Smith în 1978 . Mai târziu, Michael Smith a împărțit Premiul Nobel pentru Chimie în octombrie 1993 cu Kary Mullis , care a inventat reacția în lanț a polimerazei .

Procedura de bază necesită sinteza unui primer scurt ADN . Acest primer sintetic conține mutația dorită și este complementar ADN-ului șablon din jurul locului viitoarei mutații, astfel încât să se poată hibridiza cu ADN-ul din genom. O mutație poate fi o singură schimbare de bază ( mutație punctuală ), o schimbare de bază multiplă, o ștergere sau o inserție . Primerul monocatenar este apoi extins folosind o ADN polimerază care copiază restul genei. Astfel, gena replicată conține un situs mutant și este apoi introdusă într-o celulă gazdă ca vector și donată. În cele din urmă, mutanții sunt selectați prin secvențierea ADN pentru a se asigura că conțin mutația dorită.

Metoda originală care utilizează extensia unică de primer a fost ineficientă din cauza randamentului scăzut al mutanților. Amestecul rezultat conține atât proba originală nemutată ( tip sălbatic ), cât și catena de ADN mutantă, formând astfel o populație mixtă de mutanți și non-mutanți. În plus, tipul sălbatic utilizat este sub formă metilată, în timp ce la mutant catena este nemetilată și mutanții pot fi restricționați din cauza nepotrivirii sistemului de modificare-restricționare, rezultând mai puțini mutanți. Prin urmare, au fost dezvoltate ulterior metode pentru a îmbunătăți eficiența mutagenezei.

Metode

Un număr mare de metode sunt disponibile pentru mutageneza dirijată, deși majoritatea dintre ele sunt acum rareori utilizate în laboratoare de la începutul anilor 2000, deoarece noile tehnologii moderne oferă modalități mai ușoare de a introduce o mutație la un anumit loc într-o genă.

Metoda lui Kunkel

În 1985, Thomas Kunkel a aplicat o metodă care facilitează selectarea mutanților. Fragmentul de ADN care urmează să fie mutat este inserat în fasmide cum ar fi M13mp18/19 și apoi transformat într-o tulpină de E. coli deficitară în două enzime, dUTPaza (UI) și uracil glicozilaza (UDG). Ambele enzime fac parte din sistemul de reparare a ADN-ului care protejează cromozomul bacterian de mutațiile spontane de dezaminare de la dCTP la dUTP. Deficiența dUTPazei previne distrugerea dUTP, rezultând un nivel ridicat de dUTP în celulă. Un deficit de uracil glicozilază împiedică îndepărtarea uracilului din ADN-ul nou sintetizat. Pe măsură ce ADN-ul fag se replic în dublu mutant E. coli , sistemul său enzimatic poate astfel insera incorect dUTP în loc de dTTP, rezultând ADN monocatenar care conține mai mulți uracili (ssU-ADN). SsU-ADN este apoi extras din bacteriofag care este eliberat în mediu și apoi utilizat ca matriță pentru mutageneză. O oligonucleotidă care conține mutația dorită este utilizată pentru a extinde primerul. Heteroduplexul ADN rezultat constă dintr-o catenă părinte non-mutant care conține dUTP și o catenă mutantă care conține dTTP. ADN-ul este apoi transformat într-o tulpină de E. coli care poartă genele IU și UDG de tip sălbatic. Catena de ADN parental care contine uracil este apoi degradata, astfel incat aproape tot ADN-ul rezultat consta din catena mutanta.

Mutageneza casetei

Spre deosebire de alte metode, mutageneza casetei nu poate implica extensia primerului folosind ADN polimeraza. În această metodă, un fragment de ADN este sintetizat și apoi inserat într-o plasmidă. Ea implică digestia cu o enzimă de restricție la un loc din plasmidă și legarea ulterioară a unei perechi de oligonucleotide complementare care conțin o mutație în gena de interes din plasmidă. În mod obișnuit, enzimele de restricție care taie plasmida și oligonucleotida sunt aceleași, dând capete lipicioase plasmidei și inserții care să se lege între ele. Această metodă poate produce mutanți cu eficiență aproape de 100%, dar este limitată de prezența site-urilor de restricție adecvate care flanchează situl care urmează să fie mutat.

Mutageneză direcționată pe situs PCR

Numărul limitat de situsuri de restricție în mutageneza casetei poate fi depășit prin reacția în lanț a polimerazei cu „amorsări” oligonucleotidice, astfel încât să se formeze un fragment mai mare care cuprinde două situsuri de restricție convenabile. Amplificarea exponențială PCR produce un fragment care conține mutația dorită în cantitate suficientă pentru a fi separat de plasmida originală, nemutată, prin electroforeză pe gel, care poate fi apoi inserată în contextul original utilizând tehnici standard de biologie moleculară recombinată. Există multe variante ale acestei metode. Cea mai simplă metodă plasează locul de mutație la un capăt al fragmentului, rezultând una dintre cele două oligonucleotide utilizate pentru a genera fragmentul care conține mutația. Această metodă include o etapă PCR, dar încă are problema de a necesita un situs de restricţie adecvat lângă situsul de mutaţie, cu excepţia cazului în care este utilizat un primer foarte lung. Prin urmare, alte variante utilizează trei sau patru oligonucleotide, dintre care două pot fi oligonucleotide non-mutagene care se întind pe două situsuri de restricție și produc un fragment care poate fi restricționat și legat într-o plasmidă, în timp ce o oligonucleotidă mutagenă poate fi complementară cu o locație din acest fragment. de la orice site convenabil de restricții. Aceste metode necesită mai multe etape PCR, astfel încât fragmentul final care urmează să fie ligat să poată conține mutația dorită. Procesul de proiectare pentru a genera un fragment cu mutația dorită și locurile de restricție adecvate poate fi greoi. Programe precum SDM-Assist pot simplifica acest proces.

Mutageneză plasmidă întreg

Pentru manipularea plasmidelor, alte tehnici de mutageneză direcționată pe situs au fost înlocuite de metode care sunt foarte eficiente, dar relativ simple și ușor de utilizat și, de asemenea, disponibile comercial ca kit. Un exemplu al acestor metode este metoda QuikChange, în care o pereche de primeri mutageni complementari este utilizată pentru a amplifica întreaga plasmidă într-o reacție de termociclare folosind o ADN polimerază de înaltă fidelitate, fără deplasarea catenelor, cum ar fi polimeraza pfu . Reacția produce ADN tăiat, circular. ADN-ul șablon trebuie eliminat prin digestie enzimatică cu o enzimă de restricție precum DpnI , care este specifică pentru ADN-ul metilat . Tot ADN-ul obținut din majoritatea tulpinilor de E. coli va fi metilat; O probă de plasmidă care este sintetizată în E. coli va fi astfel restricționată, în timp ce o plasmidă mutantă care este generată in vitro va fi nemetilată și rămâne nerestricționată. Trebuie remarcat faptul că în aceste metode de mutageneză plasmidă dublu catenară, în timp ce reacția de termociclare poate fi utilizată, nu este nevoie de amplificarea ADN-ului în PCR. În schimb, amplificarea este liniară și, prin urmare, nu se poate spune că este PCR, deoarece nu este implicată o reacție în lanț.

Trebuie remarcat faptul că polimeraza pfu poate deveni deplasare a lanțului la o temperatură de alungire mai mare (≥70°C), ceea ce poate duce la eșecul experimentului, așa că reacția de ejlogare trebuie efectuată la temperatura recomandată de 68°C. În unele aplicații, această metodă are ca rezultat inserarea mai multor copii ale primerilor. O variantă a acestei metode, numită SPRINP, previne acest artefact și a fost utilizată în diferite tipuri de mutageneză direcționată.

Mutageneză direcționată pe site in vivo

CRISPR

Din 2013, dezvoltarea tehnologiei CRISPR/Cas9 a făcut posibilă introducerea eficientă a mutațiilor punctuale în genomul unei game largi de organisme. Metoda nu necesită inserarea unui sit de transpozon , nu lasă un marker, iar eficiența și simplitatea ei au făcut-o metoda preferată pentru editarea genomului.

Aplicație

Mutageneza direcționată pe site este utilizată pentru a genera mutații care pot produce o proteină concepută rațional care are proprietăți îmbunătățite sau speciale (ingineria proteinelor).

Instrumente de cercetare  - mutații specifice ale ADN-ului care vă permit să explorați funcțiile și proprietățile unei secvențe de ADN sau proteine ​​într-o abordare rațională. În plus, modificările unui singur aminoacid prin mutageneză direcționată în proteine ​​pot ajuta la înțelegerea importanței modificărilor post-translaționale. De exemplu, schimbarea unei anumite serine (fosfo-acceptor) cu alanină (un fosfo-non-acceptor) într-un substrat proteic blochează gruparea fosfat atașată, permițând astfel examinarea fosforilării. Această abordare a fost folosită pentru a descoperi fosforilarea proteinei CBP de către kinaza HIPK2 .

Aplicații comerciale  - Proteinele pot fi proiectate pentru a produce forme mutante adaptate unei anumite aplicații. De exemplu, detergenții de rufe utilizați în mod obișnuit pot conține subtilizină , care are metionină de tip sălbatic , care poate fi oxidată cu înălbitor, reducând foarte mult activitatea proteinelor în proces. Această metionină poate fi înlocuită cu alanină sau alte reziduuri, făcând-o rezistentă la oxidare, menținând astfel proteina activă în prezența înălbitorului.

Sinteza genelor

Pe măsură ce costul sintetizării oligonucleotidelor ADN scade, sinteza artificială a întregii gene este în prezent o metodă viabilă de a introduce mutația într-o genă. Această metodă permite mutageneza extinsă a multor site-uri, inclusiv reproiectarea completă a utilizării codonului unei gene pentru a o optimiza pentru un anumit organism.

Vezi și

Note

  1. ↑ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (iunie 2014). „Dezvoltarea și aplicațiile CRISPR-Cas9 pentru ingineria genomului” . celula . 157 (6): 1262-78. DOI : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . PMC  4343198 . PMID24906146  . _

Link -uri

  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii