Regiunea 3' -netradusă (3'-UTR , engleză 3'-regiune netradusă, 3'-UTR ) este o regiune necodifică a ARNm situată la capătul său 3' după regiunea codificatoare . Regiunea ADN corespunzătoare 3’-UTR a transcriptului are același nume [1] . 3′-UTR poate fi implicat în reglarea eficienței translației și stabilității ARNm, conține semnale de poliadenilare [2] și situsuri de legare a microARN și, de asemenea, îndeplinește o serie de alte funcții de reglare.
Lungimea 3'-UTR poate fi de la 60 la 4000 de nucleotide . Lungimea medie a 3’-UTR la om este de aproximativ 800 de nucleotide, în timp ce lungimea medie a 5’-UTR este de 200 de nucleotide [3] . Este de remarcat faptul că lungimea totală a 3′-UTR la om este mai mult de două ori mai mare decât la alte mamifere , ceea ce indică un număr mai mare de elemente de reglare la om decât la alte mamifere [4] . Compoziția bazelor diferă și în 3’- și 5’-UTR. Astfel, conținutul de G + C este mai mare în 5'-UTR decât în 3'-UTR. Această diferență este vizibilă în special în ARNm al vertebratelor cu sânge cald , în care conținutul de G+C în 5’-UTR este de 60%, iar în 3’-UTR este de 45% [5] [6] .
Lungimea și structura secundară a 3’-UTR sunt în mare măsură determinate de participarea sa la interacțiunile dintre capătul 5’ al transcrierii și capătul 3’ (a se vedea mai jos), iar adesea 3’-UTR-urile lungi au o valoare semnificativă. efect asupra expresiei genelor . În 1996, s-a demonstrat că creșterea ARNm 3'-UTR de la 19 la 156 de nucleotide a redus expresia cu un factor de 45, indiferent de orientarea, gena sau secvența nucleotidelor inserate. Aceasta indică faptul că lungimea 3'-UTR este importantă în exprimarea ARNm. Un alt factor care determină importanța lungimii 3’-UTR, pe lângă interacțiunea dintre 3’- și 5’-UTR, este capacitatea 3’-UTR de a interacționa cu miARN , molecule speciale de ARN reglatoare care suprimă translația ( vezi mai jos pentru mai multe detalii). Aceste interacțiuni au loc în locuri speciale, care sunt mai abundente în 3′-UTR lungi, astfel încât un 3′-UTR lung poate avea un efect inhibitor mai puternic asupra translației. Astfel, s-a făcut o comparație a lungimii 3′-UTR și a numărului de situsuri de legare a microARN de pe acesta în genele proteinelor ribozomale și genele implicate în neurogeneză . S-a dovedit că genele ribozomale 3′-UTR sunt mai scurte și au mai puține site-uri specifice de legare a microARN, în timp ce în genele implicate în neurogeneză, dimpotrivă, 3′-UTR este mai lungă și conține multe site-uri specifice de legare a microARN. Să luăm în considerare un alt exemplu. Gena Hip2 folosește alternative 3′-UTR pentru controlul flexibil al expresiei (a se vedea mai jos pentru mai multe despre acest fenomen). 3′-UTR mai lung posibil al acestei gene conține situsuri de legare conservate pentru două miARN exprimate în celulele T activate . La activare, expresia relativă a transcriptului cu un 3′-UTR mai lung a scăzut, iar expresia proteinei totale a crescut, deoarece s-au exprimat ARNm cu 3′-UTR mai scurte, care nu conțineau site-uri de legare pentru miARN inhibitori. De asemenea, s-a demonstrat că lungimea 3′-UTR depinde de prezența unor astfel de elemente de reglementare precum elemente bogate în AU ( ARE ) în el (pentru mai multe detalii, vezi mai jos) [4] .
În general, 3′-UTR-urile lungi sunt asociate cu un nivel relativ scăzut de expresie, așa cum se arată în experimentele care au comparat expresia izoformelor unei singure proteine ale cărei ARNm diferă doar în lungimea 3′-UTR. Gena SLC7A1 este exprimată în două ARNm cu 3’-UTR-uri diferite, cel mai lung conținând un situs suplimentar de legare a microARN-ului. Polimorfismul funcțional la această genă este asociat cu apariția disfuncției endoteliale și cu o predispoziție ereditară la hipertensiune arterială . Interesant este că alela responsabilă de manifestarea acestor tulburări are de obicei un 3’-UTR mai lung și, prin urmare, nivelul său de expresie este mai scăzut decât cel al alelei de tip sălbatic , care are un 3’-UTR mai scurt [4] .
Spre deosebire de 5'-UTR, 3'-UTR conțin relativ puțini introni (aproximativ 5%). Unele gene de mamifere rezultate din transcrierea inversă dintr-o transcriere îmbinată au introni în 3′-UTR care reduc expresia acestor gene, direcționând transcriptele lor către calea NMD (adică, perturbare). Acest efect negativ al intronilor din 3′-UTR asupra expresiei genelor poate explica distribuția lor scăzută în această regiune. Mai mult, s-a descoperit că unele transcrieri sunt capabile să se lege de miARN numai în prezența unui intron în 3′-UTR, care suprimă și expresia genei. Acest lucru arată că excizia diferită de introni în 3′-UTR permite reglarea mediată de microARN specific izoformei, care poate fi efectuată într-o manieră specifică țesutului [7] .
Aparent, structura secundară a 3’-UTR are o importanță mult mai mare decât se credea anterior. Nu numai că lungimea 3’-UTR este importantă, dar și structura sa secundară, iar mutațiile care îl modifică pot perturba expresia genelor. În 2006 s-a realizat un studiu pe 83 de variante 3′-UTR asociate cu diverse boli și s-a stabilit o relație între funcționalitatea acestor variante și modificările structurii secundare prezise [8] .
Structura secundară a 3′-UTR este dificil de prezis, deoarece mulți factori proteici care se leagă de acesta pot afecta în mod semnificativ structura sa spațială. Acești factori îl pot schimba datorită distrugerii pliului ARNm sau pot interacționa cu alți factori, datorită cărora ARNm se poate închide într-o buclă. Cel mai comun exemplu de elemente de structură secundară care pot afecta expresia este ac de păr , iar proteinele care leagă ARN se leagă de ac de păr în 3'-UTR. Transcriptul factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF ) conține un ac de păr lung responsabil pentru stabilitatea ARNm în neuroni ca răspuns la semnalele de calciu . Se presupune că ac de păr este o platformă convenabilă pentru interacțiunea unui număr de proteine de legare a ARN, ARN-uri necodificatoare și semnale de poliadenilare ca răspuns la Ca2 + . 3′-UTR al transcriptului TNFα conține elementul ARE , care formează un ac de păr care poate modula afinitatea acestei regiuni pentru diferite proteine (pentru mai multe detalii, vezi mai jos). Aceste exemple arată că modularea structurii secundare a 3’-UTR prin proteine sau alte mijloace poate modifica specificitatea de legare a diferiților factori trans , reglând astfel expresia genelor la nivel post- transcripțional [ 9] .
Poliadenilarea alternativă ( APA ) și splicing alternativă sunt două mecanisme care duc la apariția diferitelor izoforme de ARNm care diferă în 3′-UTR-urile lor . APA poate apărea din cauza prezenței diferitelor situsuri de poliadenilare și a diferiților exoni terminali ; Se estimează că APA utilizează ~ 50% din genele umane. Acest mecanism este foarte convenabil pentru organisme complexe, deoarece permite transcrierilor să exprime aceeași proteină, dar la niveluri diferite și în locații spațiale diferite, datorită diferențelor în reglarea mediată de 3′-UTR. 3′-UTR-urile alternative sunt extrem de importante pentru expresia genelor specifice țesutului, precum și pentru exprimarea variabilă în diferite stadii de dezvoltare . Schimbările semnificative ale produselor ARA sunt caracteristice unui număr de tipuri de cancer . ARA joacă, de asemenea, un rol important în localizarea izoformei proteinelor. Produsul proteic al genei HuR este o proteină care leagă ARE implicată în stabilizarea multor ARNm care conțin ARE. Datorită ARA, se formează o serie de variante ale proteinei HuR, care diferă în ceea ce privește nivelul de exprimare și, deși marea majoritate a transcrierilor acestei proteine lipsesc ARE, unele au încă ARE funcționale în 3′-UTR. Aceste ARE sunt capabile să lege HuR, oferind astfel o reglementare pozitivă a feedback-ului. Astfel, utilizarea alternativelor 3'-UTR permite o diversitate și mai mare a produselor proteice ale unei singure gene [10] .
MicroARN -urile sunt molecule scurte de ARN necodificatoare, monocatenar , de origine endogenă, cu o lungime de aproximativ 20 de nucleotide. Ele interacționează cu ARNm-urile țintă conform principiului complementarității și de obicei blochează traducerea țintei sau provoacă distrugerea acesteia. De regulă, situsurile de legare microARN-ARNm sunt situate în 3′-UTR al acestuia din urmă, deși unele dintre ele sunt localizate în 5′-UTR și chiar în regiunea de codificare. MicroARN-urile sunt adesea exprimate diferit în funcție de tipul de țesut și stadiul de dezvoltare, iar genele implicate în procesele comune tuturor genelor trebuie să evite în mod selectiv secvențele din transcrieri care sunt parțial complementare microARN-urilor, adică pentru a evita prezența situsurilor de legare a microARN. Acest proces de evitare selectivă are un impact uriaș asupra evoluției 3′-UTR [11] .
Modificarea stabilității transcrierii permite controlul rapid al expresiei fără modificarea ratei de traducere. Un astfel de mecanism este important în procese vitale precum creșterea și diferențierea celulelor , precum și adaptarea la condițiile de mediu. Cele mai bine studiate elemente de reglare care reglează stabilitatea ARNm sunt elementele bogate în AU ( ARE ) situate în 3′-UTR al ARNm al unor gene . Aceste elemente variază în mărime de la 50 la 150 de nucleotide și de obicei conțin mai multe copii ale pentanucleotidei AUUUA [12] .
S-a constatat că secvențele de ARE diferă și 3 clase de ARE se disting prin numărul și aranjarea motivelor AUUUA:
ARE se leagă de proteine ( ARE -binding proteins, ARE-BPs ), care, de regulă, contribuie la distrugerea ARNm ca răspuns la diferite semnale intra- și extracelulare, deși unele dintre ele reglează translația . ARE reglează expresia genelor care codifică citokine , factori de creștere , gene supresoare tumorale , proto-oncogene și gene ale căror produse proteice sunt implicate în reglarea ciclului celular , cum ar fi gene pentru cicline , enzime , factori de transcripție , receptori și proteine de membrană . Această diversitate de gene ale căror transcrieri conțin ARE indică importanța stabilității transcriptului în reglarea genelor [12] . Pe lângă schimbarea stabilității ARNm, ARE-urile pot activa și translația, deși acest mecanism este mai puțin comun și mai puțin înțeles [13] .
Un alt element care reglează stabilitatea transcrierii este elementul bogat în GU (GRE) descoperit recent . Interacționează cu CUGBP1 , o proteină care leagă ARN-ul care promovează descompunerea ARNm asociată [13] .
Poliadenilarea este procesul de adăugare a unei serii de adenozine (adică, o coadă poli(A)) la capătul 3’ al unui transcript de ARN imatur [13] . S-a stabilit că 3′-UTR conține elemente care reglează acest proces. Astfel, s-a demonstrat că toate ARNm de poliadenilare aflate la o distanță de 20–30 de nucleotide de capătul 3’ al transcriptului, de care este atașată coada poli(A), conțin secvența AAUAAA, un semnal de poliadenilare (semnale de poliadenilare). pot fi, de asemenea, secvențe apropiate, cum ar fi AU /GUAAAA sau UAUAAA). Ulterior, s-a dovedit că, deși secvența AAUAAA este absolut necesară pentru poliadenilare, există și alte elemente fără de care atașarea normală a cozii poli(A) este imposibilă. În special, o secvență bogată în GU a fost identificată imediat după AAUAAA spre capătul 3’ (se mai numește și elementul de secvență în aval englezesc , DSE ), precum și o secvență specială situată imediat înainte de AAUAAA ( element de secvență în amonte în engleză , USE ) . Aceste elemente sunt în mare parte conservate nu numai pentru mamifere , ci și pentru toate eucariotele . Pentru poliadenilare, nucleotidele situate la locul tăieturii la capătul 3′ al transcriptului sunt de asemenea importante (coada poli(A) va fi atașată la acest loc după rupere). Astfel, 3′-UTR joacă un rol crucial în procesul de poliadenilare [14] .
3′-UTR joacă un rol esențial în procesul de mascare a ARNm . Mascarea ARNm are loc, de exemplu, în timpul oogenezei și spermatogenezei , când ARNm-ul sintetizat în timpul acestor procese nu este tradus în proteine, ci este stocat într-o stare inactivă, uneori pentru o perioadă destul de lungă. În timpul fertilizării și în timpul embriogenezei timpurii , ARNm-urile materne sunt demascate și proteinele necesare sunt sintetizate din acestea. Mascarea și stocarea ARNm are loc și în diferențierea celulelor somatice ale unui organism adult pentru o lungă perioadă de timp [15] .
Fenomenul de mascare a ARNm a fost studiat pentru prima dată la molusca bivalvă Spisula solidissima în 1990. S-a dovedit că o cantitate mare de ARNm mascat care codifică subunitatea mică a ribonucleotid reductazei și ciclina A este stocată în ovocitele sale . S-a demonstrat că atunci când ARNm este într-o stare mascata, un complex de proteine de mascare este asociat cu situsul din 3'-UTR-ul său. De asemenea, s-a dovedit că ARNm-urile mascate au o coadă poli(A) puternic scurtată, de la 200-250 de resturi de adenil la 20-40. Când ARNm este demascat, proteinele de mascare sunt fosforilate , în urma căreia capacul este eliberat din proteina de blocare și este stimulată poliadenilarea ARNm de către poli(A)polimeraza citoplasmatică , restabilind coada lungă de poli(A) necesară pentru traducere eficientă [16] .
3′-UTR este uneori implicat în procesul de încorporare a unui aminoacid rar, dar important din punct de vedere funcțional , selenocisteina , în lanțul polipeptidic . Nu există un codon special pentru selenocisteină, iar ARNt Sec este atașat la codonul de terminare UGA, dar numai atunci când este urmat de o secvență specială de inserție a selenocisteinei - SECIS , care formează un element caracteristic al structurii secundare. SECIS poate fi localizat la o distanță considerabilă (până la 200 de nucleotide) de UGA, iar la arhee și eucariote este localizat în 3′-UTR al ARNm [17] [18] .
NMD ( nonsens-mediated decay ) este un mecanism eficient pentru distrugerea transcriptelor mutante nefuncționale . De obicei, eficiența în acest mecanism este determinată de locația mutației în raport cu joncțiunea exonului, cu toate acestea, 3'-UTR poate juca, de asemenea, un anumit rol. Mecanismul de terminare a translației la codonii de oprire prematură depinde de distanța dintre codonul terminator și proteina de legare poli(A) PABPC1 . S-a demonstrat că o creștere a distanței dintre codonul stop și coada poli(A) declanșează NMD, iar modificările în structura spațială a 3'UTR pot modula NMD [8] .
Se știe că ARNm este capabil să se închidă într-un inel (circularizare) datorită interacțiunii proteinelor speciale care se leagă la coada poli(A) , facilitând legarea factorului eIF4F de capac . Ca rezultat, ARNm capătă o formă închisă, inițierea traducerii este stimulată și eficiența traducerii este crescută. Cu toate acestea, în unele cazuri, 5’-UTR și 3’-UTR ale aceluiași ARNm se pot lega unul de celălalt. De exemplu, ARNm al genei umane p53 are regiuni în 5′-UTR și 3′-UTR care sunt complementare unele cu altele. Prin legarea unul de celălalt și de factorul de translație RPL26 , ei cresc astfel eficiența translației proteinei p53 ca răspuns la deteriorarea ADN -ului [8] .
Analiza mARN-urilor diferitelor gene umane a arătat că 5′-UTR conține motivul care interacționează în mod specific cu capetele 3′ ale microARN-urilor, în timp ce multe dintre aceste mARN-uri au un situs complementar cu 3′-UTR la capătul 5′. . Studii suplimentare au arătat că legarea 5’-UTR la miARN facilitează legarea capătului 5’ al ARNm la capătul 3’, iar ARNm a căror activitate este puternic determinată de miARN au situsuri de legare previzibile pe ambele UTR. Astfel de ARNm se numesc miBridge. S-a constatat, în plus, că pierderea acestor situsuri de legare a redus reprimarea transcriptului determinată de miARN. Astfel, s-a descoperit că situsurile de legare UTR între ele sunt necesare pentru a suprima traducerea ARNm. Acest lucru indică faptul că interacțiunea complementară a 5′-UTR și 3′-UTR este necesară pentru reglarea precisă a expresiei genelor [9] .
ARNm bacterian conține, de asemenea, regiuni 5’- și 3’-netraduse [19] [20] .
Spre deosebire de eucariote, 3′-UTR lungi sunt rare la bacterii și prost înțelese. Cu toate acestea, unele bacterii, în special Salmonella enterica , sunt cunoscute că au ARNm cu 3'-UTR lungi asemănătoare eucariotelor (în S. enterica , acesta este ARNm hilD ). Se presupune că hilD 3′-UTR îndeplinesc diverse funcții, în special, ele afectează turnover-ul ARNm-urilor lor, deoarece ștergerea acestor regiuni a determinat o creștere a cantității de ARNm corespunzătoare [21] .
Regiunile netraduse există și în ARNm al multor arhee . În special, în ARNm 5’- și 3’-UTR al arheei metanogenice Methanococcus jannaschii (ca și în alți reprezentanți ai ordinelor Methanopyrales și Methanococcales ), este localizat elementul SECIS , care este responsabil pentru inserarea aminoacid selenocisteină în lanțul polipeptidic [22] .
S-a stabilit că ARNm al majorității haloarheilor , precum și celor din Pyrobaculum și Sulfolobus , nu au un 5’-UTR pronunțat, dar ARNm al metanogenilor arheeni are 5’-UTR lungi. În acest sens, se presupune că mecanismul de inițiere a translației în arheile metanogene poate fi diferit de cel al altor reprezentanți ai acestui domeniu [23] . Cu toate acestea, ARNm haloarheal conține 3'-UTR-uri și capetele lor 3' nu suferă modificări post-transcripționale. În mod surprinzător, acelor transcrieri haloarheale care au un 5'-UTR le lipsește secvența Shine-Dalgarno. Lungimea 3'-UTR a haloarheilor a variat de la 20 la 80 de nucleotide; nu au fost identificate motive și secvențe structurale conservate, cu excepția penta-U-nucleotidei din regiunea de terminare a translației [24] .
În mulți viruși , inițierea translației are loc printr-un mecanism independent de capac și are loc prin elementele IRES situate în 5′-UTR [25] . Cu toate acestea, un alt mecanism de inițiere a traducerii independent de capac a fost găsit în viruși care nu este asociat cu IRES. Acest mecanism este prezent în multe virusuri ale plantelor . În acest caz, există un element special de traducere independent de cap (CITE) situat în 3′-UTR. Adesea, CITE leagă factori de translație, de exemplu, complexul eIF4F, și apoi interacționează complementar cu capătul 5’, furnizând factori de inițiere a translației la locul de început [26] .
La virusurile al căror genom este reprezentat de o moleculă de ARN monocatenar cu polaritate pozitivă , 3′-UTR nu numai că afectează translația, ci este și implicat în replicare : de la aceasta începe replicarea genomului viral [27]. ] .
Virusul rujeolei (genul Morbillivirus din familia Paramyxoviridae ) are un genom reprezentat de o moleculă de ARN monocatenar cu polaritate negativă. A fost stabilit un mecanism interesant pentru genele sale M și F. ARNm-urile acestor gene au UTR lungi; ele reprezintă ~ 6,4% din ARNm total. Deși aceste gene nu sunt direct implicate în replicare , ARNm 3′-UTR al genei M crește expresia proteinei M și, prin urmare, declanșează replicarea genomului. În același timp, 5′-UTR al ARNm al genei F reduce formarea proteinei F și astfel suprimă replicarea [28] .
Când studiază structura și funcția 3′-UTR, oamenii de știință folosesc mai multe metode diferite. Chiar dacă se arată că un anumit 3′-UTR este prezent într-un anumit țesut, pentru a obține o imagine completă a funcțiilor sale, este necesar să se analizeze efectele diferitelor sale localizări, să se determine durata de funcționare, să se descrie interacțiunile cu trans- proteinele de reglare și efectul asupra eficienței translației [29] . Folosind metode bioinformatice , bazate pe analiza structurii primare (adică, secvența de nucleotide), se pot căuta elemente ARE și situsuri de legare a microARN într-un 3'-UTR dat. Metodele experimentale stabilesc secvențe care interacționează cu anumite proteine trans-regulatoare, iar în momentul de față, pe baza datelor de secvențiere și a datelor experimentale, este posibil să se găsească locuri de interacțiune cu anumite proteine într-o transcriere dată [30] . Prin inducerea artificială a mutațiilor în 3′-UTR, cum ar fi cele care afectează codonul terminator, semnalul de poliadenilare sau structura secundară a 3′-UTR, este posibil să se stabilească modul în care mutațiile din aceste regiuni pot duce la tulburări de translație și apariția bolilor (mai multe despre bolile asociate cu 3′ -UTR, vezi mai jos) [31] . Deci, cu ajutorul tuturor acestor metode, ne putem dezvolta înțelegerea structurii și funcțiilor elementelor cis-regulatoare din 3′-UTR, precum și a proteinelor care interacționează cu 3′-UTR.
Mutațiile care afectează 3′-UTR sunt importante deoarece o astfel de mutație poate afecta expresia multor gene. Deși la nivel transcripțional, mutațiile afectează alela specifică și genele legate fizic, deoarece proteinele de legare 3′-UTR sunt, de asemenea, implicate în procesarea și exportul ARNm din nucleu. Astfel, o mutație poate afecta gene neînrudite [32] . De exemplu, mutațiile în ARE duc la funcționarea defectuoasă a proteinelor care leagă ARE, ducând la dezvoltarea unor boli precum degenerarea malignă a organelor hematopoietice și leucemia [33] [34] . Un conținut crescut de trinucleotidă CTG în 3′-UTR al genei miotoninei protein kinazei cauzează distrofie miotonică . Inserția unui retrotransposon de 3 kb constând din repetări tandem în 3′-UTR al genei proteinei fukutin a fost asociată cu distrofia musculară congenitală de tip Fukuyama [29] . Modificări ale elementelor localizate în 3′-UTR sunt asociate cu dezvoltarea unor astfel de boli umane precum leucemia mieloidă acută , alfa talasemie , neuroblastom , keratinopatie, aniridia , sindromul IPEX , malformații cardiace congenitale [31] . Asocierea unora dintre aceste boli cu elemente specifice 3′-UTR este prezentată în diagrama de mai jos.