Anti-CRISPR ( în engleză Anti-CRISPR ) este un sistem proteic , datorită căruia bacteriofagii (atât bacteriile , cât și arheile ) rezistă acțiunii distructive a sistemelor CRISPR /Cas. Sistemele anti-CRISPR au fost descrise la mulți bacteriofagi. Proteinele acestor sisteme interferează în majoritatea cazurilor cu procesul de recunoaștere a țintei și cu activitatea proteinelor Cas. Sistemele anti-CRISPR pot fi de importanță biotehnologică , deoarece pot fi utilizate pentru a ajusta editarea genomului folosind tehnologia CRISPR/ Cas9 .
Înainte de descoperirea anti-CRISPR, singura modalitate cunoscută prin care fagii evită să fie distruși de sistemul CRISPR/Cas a fost prin dobândirea de mutații punctuale . Ele practic nu afectează viabilitatea fagului, dar perturbă complementaritatea împerecherii ADN -ului fagului cu ARN-ul ghid , din cauza căreia sistemul CRISPR/Cas nu poate recunoaște materialul genetic viral . Cu toate acestea, microorganismele găsesc rapid o modalitate de a ocoli această protecție inserând noi fragmente de ADN străin în genomul lor. Primele proteine anti-CRISPR au fost descoperite în 2013 în mai mulți fagi înrudiți care atacă bacteria Pseudomonas aeruginosa . Teoretic, dacă un fag se integrează în genomul unei bacterii care are un sistem activ CRISPR/Cas, bacteria va muri pentru că își taie propriul genom. Cu toate acestea, inserarea unor fagi în genomul bacteriilor cu CRISPR/Cas activ nu a dus la moartea celulelor. Când se compară genomul fagilor care provoacă moartea celulelor bacteriene și fagii care nu duc la moartea celulelor, s-a dovedit că aceștia din urmă au un loc special care conține zece gene complet diferite și foarte scurte (150-450 de nucleotide lungime ). S-a dovedit că produsele proteice a cinci dintre ele (acrF1-acrF5) perturbă sistemul CRISPR/Cas de tip IF la P. aeruginosa , iar încă patru (acrE1-acrE4) blochează sistemul de tip IE în aceeași bacterie. Genele anti-CRISPR au fost identificate nu numai în fagii P. aeruginosa , ci și în plasmidele și insulele conjugative ale acestei bacterii [1] .
Secvențele de aminoacizi ale proteinelor anti-CRISPR variază foarte mult și nu au niciun motiv comun care ar ajuta la identificarea genelor similare în genomul altor bacteriofagi folosind metode bioinformatice standard . Cu toate acestea, s-a dovedit că mediul genelor anti-CRISPR este foarte asemănător: după genele anti-CRISPR în sine, toate au o genă care codifică factorul de transcripție Aca1 ( anti-CRISPR asociat 1 ) [1] . Fagilor lipsiți de gene anti-CRISPR le lipsește și gena aca1 . Mai mult, genele anti-CRISPR și gena aca1 formează un singur operon , iar proteina Aca1 pare să regleze expresia anti-CRISPR în funcție de stadiul ciclului de infecție a fagilor . Proteina Aca1 are un motiv structural helix-turn-helix , care se găsește adesea printre factorii de transcripție. Pentru a stabili dacă regiunea studiată a genomului bacteriofagului codifică proteine anti-CRISPR, oamenii de știință au verificat prezența imediat după aceasta a unei gene care codifică o proteină cu motivul „helix-turn-helix”. Folosind această abordare, proteinele anti-CRISPR care acționează împotriva sistemelor de tip I au fost descoperite în bacteriofagi ai unei varietăți de proteobacterii . Aceeași abordare a condus la descoperirea sistemelor de tip II care perturbă anti-CRISPR [1] [2] .
Recent, a fost creată o bază de date cu proteine anti-CRISPR, antiCRISPRdb, în care oricine poate găsi informații cunoscute despre o proteină anti-CRISPR de interes [3] .
Astăzi, sunt cunoscute 22 de familii de proteine anti-CRISPR . Ele sunt unite doar prin dimensiunea lor mică (de la 50 la 150 de resturi de aminoacizi), nu au niciun motiv comun și niciunul dintre ei nu seamănă cu nicio proteină cu o funcție cunoscută. Prin urmare, s-a dovedit a fi imposibil de sugerat mecanismul de acțiune al anti-CRISPR folosind bioinformatica. Până acum, a fost posibil să se stabilească mecanismul de acțiune a șase proteine anti-CRISPR folosind abordări genetice , biochimice și structurale. Teoretic, proteinele anti-CRISPR pot influența funcționarea CRISPR/Cas în mai multe etape [1] . Ei pot:
În prezent, a fost descrisă acțiunea proteinelor anti-CRISPR în ultimele două scenarii. De exemplu, proteinele AcrF1 și AcrF2 se atașează la complexul de proteine Cas și ARN, împiedicându-l să se lege de ADN-ul străin. Proteina AcrF3 interacționează cu proteina Cas3, care are activități helicaze și nuclează și o împiedică să se alăture complexului de alte proteine Cas și ARN care a legat deja ADN-ul țintă. AcrIIC1 se leagă de domeniul nuclează al proteinei Cas9 (singura proteină Cas din sistemele de tip II), împiedicând-o să taie ADN-ul [1] .
Unele proteine anti-CRISPR sunt active împotriva mai multor sisteme CRISPR/Cas. De exemplu, proteinele anti-CRISPR care acționează împotriva sistemelor de tip II-A suprimă funcția proteinelor omoloage Cas9, ale căror secvențe de aminoacizi sunt doar 53% similare [1] [2] .
Studii recente au arătat că doar mutațiile punctiforme nu sunt suficiente pentru ca bacteriofagii să scape de acțiunea CRISPR/Cas. Fagul trebuie să aibă cel puțin o genă anti-CRISPR pentru a evita uciderea completă atunci când este co-cultivat cu bacterii cu sisteme CRISPR/Cas active. Aparent, o selecție atât de puternică contribuie la diversitatea secvențelor de aminoacizi și a mecanismelor de acțiune ale anti-CRISPR. Proteinele anti-CRISPR servesc ca factori importanți în evoluția microorganismelor. Astfel, inserarea elementelor genetice mobile cu genele unor astfel de proteine în genomul bacterian duce la inactivarea permanentă a sistemelor CRISPR/Cas datorită exprimării stabile a anti-CRISPR. O celulă în această stare nu poate rezista la intrarea altor elemente genetice transpozabile și, prin urmare , la transferul orizontal al genelor . Odată cu inactivarea pe termen lung a CRISPR/Cas, o bacterie poate pierde complet genele cas sau acumula mutații care le fac nefuncționale. Analiza bioinformatică a sistemelor CRISPR/Cas ale diferitelor bacterii a arătat că aproximativ 12% dintre acestea sunt nefuncționale din cauza pierderii genelor cas sau a mutațiilor dăunătoare ale acestora. S-a demonstrat experimental că în condițiile în care achiziția de ADN străin este benefică, bacteriile pot pierde complet sistemul CRISPR/Cas [2] .
În prezent, sunt cunoscute proteine anti-CRISPR care suprimă activitatea Cas9 a bacteriei Streptococcus pyogenes (această enzimă este folosită cel mai adesea pentru editarea genomilor folosind sistemele CRISPR/Cas). Mai mult, doi dintre ei o fac în celule umane , blocând editarea genomului. Prin urmare, proteinele anti-CRISPR pot regla editarea genomului de către CRISPR/Cas, de exemplu, lăsând sistemul activ doar în anumite țesuturi și organe , doar în anumite stadii de dezvoltare embrionară sau numai în anumite momente ale ciclului celular . În plus, utilizarea anti-CRISPR va ajuta la reducerea frecvenței mutațiilor neprogramate introduse de Cas9. De obicei, Cas9 este activ până când celula distruge fie enzima, fie ARN-ul ghid, iar o perioadă prea lungă de activitate Cas9 duce adesea la mutații în afara genei țintă. Mulți agenți patogeni bacterieni umani au sisteme CRISPR/Cas active, iar utilizarea proteinelor anti-CRISPR poate crește semnificativ eficacitatea terapiei cu fagi . Astfel, proteinele anti-CRISPR pot găsi o aplicație largă în biotehnologie, inginerie genetică și medicină în viitor [1] .