O serie de comutatoare biochimice controlează tranzițiile între și în cadrul diferitelor faze ale ciclului celular . Ciclul celular este o serie de evenimente complexe, ordonate, secvențiale care controlează diviziunea unei celule în două celule și include mai multe faze distincte. Fazele includ fazele G1 și G2, replicarea ADN-ului sau faza S și procesul propriu-zis de diviziune celulară, mitoză sau faza M [1] . În timpul fazei M, cromozomii se separă și are loc citokineza.
Comutatoarele mențin dezvoltarea ordonată a ciclului celular și acționează ca puncte de control pentru a se asigura că fiecare fază se finalizează corect înainte de a trece la următoarea fază [1] . De exemplu, Cdk, sau kinaza dependentă de ciclină , este un regulator principal al ciclului celular și permite celulei să treacă de la G1 la S sau de la G2 la M prin adăugarea de fosfat la substraturile proteice. S-a demonstrat că astfel de comutatoare multicomponente (care implică multe proteine interconectate) generează tranziții decisive, fiabile (și potențial ireversibile) și declanșează oscilații stabile [2] . Drept urmare, ei fac obiectul cercetărilor active care încearcă să înțeleagă modul în care aceste proprietăți complexe sunt legate de sistemele de control biologic [2] [3][4] .
Multe circuite biologice produc ieșiri complexe folosind una sau mai multe bucle de feedback . Într-o secvență de evenimente biochimice, feedback-ul se va referi la un element din aval al secvenței (B în imaginea adiacentă) care influențează o componentă din amonte (A în imaginea adiacentă) pentru a influența propria sa producție sau activare (ieșire) în viitor. Dacă acest element acționează pentru a-și crește propria producție, atunci participă la feedback pozitiv (săgeată albastră). O buclă de feedback pozitiv este cunoscută și sub numele de buclă de auto-întărire și este posibil ca aceste bucle să facă parte dintr-o buclă mai mare, deoarece acest lucru este comun în circuitele de reglare [1] .
În schimb, dacă acest element duce la propria sa inhibiție prin elementele superioare, acesta este feedback negativ canonic (săgeată roșie contonată). O buclă de feedback negativ este cunoscută și sub numele de buclă de echilibrare și pot fi observate adesea oscilații în care un semnal de feedback negativ întârziat este utilizat pentru a menține echilibrul homeostatic în sistem [1] .
Buclele de feedback pot fi folosite pentru amplificare (pozitive) sau autocorecție (negative). Combinația corectă de feedback-uri pozitive și negative poate genera hipersensibilitate și bistabilitate [5] [6] , care la rândul lor pot genera tranziții și oscilații critice.
Buclele de feedback pozitiv și negativ nu funcționează întotdeauna bine. În mecanismul comutatoarelor biochimice, ele lucrează împreună pentru a crea un sistem flexibil. De exemplu, conform lui Pfeuty & Kaneko (2009), pentru a depăși lipsa sistemelor biochimice, buclele de reglare cu feedback pozitiv pot interacționa cu buclele de reglare negative pentru a facilita recuperarea din stări stabile [7] . Coexistența a două stări stabile este cunoscută sub numele de bistabilitate, care este adesea rezultatul controlului cu feedback pozitiv.
Un exemplu care dezvăluie interacțiunea mai multor bucle de feedback negativ și pozitiv este activarea protein kinazelor dependente de ciclină sau Cdks14. Buclele de feedback pozitiv joacă un rol prin comutarea celulelor de la activitate Cdk scăzută la cea mare. Interacțiunea dintre cele două tipuri de bucle se manifestă în mitoză. În timp ce feedback-ul pozitiv inițiază mitoza, o buclă de feedback negativ promovează inactivarea kinazelor dependente de ciclină de către complexul de stimulare a anafazei. Acest exemplu arată clar efectele combinate ale feedback-ului pozitiv și negativ asupra reglării ciclului celular.
Un răspuns cu totul sau nimic la un stimul se numește hipersensibilitate . Cu alte cuvinte, o schimbare foarte mică a stimulului determină o schimbare foarte mare a răspunsului, creând o curbă doză-răspuns sigmoidală. Răspunsul suprasensibil este descris de ecuația generală V = S n /(S n + K m ), cunoscută sub numele de ecuația Hill , când n, coeficientul Hill, este mai mare decât 1. Panta curbei sigmoide depinde de valoare din n. Valoarea n = 1 dă un răspuns hiperbolic sau Michael. Ultrasensibilitatea se realizează în diverse sisteme; un exemplu notabil este legarea prin cooperare a hemoglobinei enzimei de substratul său. Deoarece răspunsul hipersensibil este aproape „digital”, acesta poate fi folosit pentru a crește răspunsul la un stimul sau pentru a face o tranziție bruscă și bruscă (între stările „oprit” și „pornit”).
Ultrasensibilitatea joacă un rol important în reglarea ciclului celular. De exemplu, Cdk1 și Wee1 sunt regulatori ai mitozei și sunt capabili să se inactiveze reciproc prin fosforilare inhibitorie. Aceasta este o buclă dublă de feedback negativ în care ambele regulatoare se inactivează reciproc. Potrivit lui Kim et al.(2007), trebuie să existe un element ultrasensibil pentru a genera un răspuns bistabil. S-a dovedit că Wee1 are un răspuns hipersensibil la Cdk1, iar acest lucru apare probabil din competiția de substrat între diferitele site-uri de fosforilare de pe Wee1 [8] .
Bistabilitatea implică histerezis , iar histerezisul implică multistabilitate. Multistabilitatea indică prezența a două sau mai multe stări stabile pentru o intrare dată. Prin urmare, bistabilitatea este capacitatea unui sistem de a exista în două stări staționare [9] . Cu alte cuvinte, există o gamă de valori de stimul pentru care un răspuns poate avea două valori în stare de echilibru. Bistabilitatea este însoțită de histerezis , ceea ce înseamnă că sistemul se apropie de una dintre cele două stări stabile, în funcție de istoricul său. Bistabilitatea necesită feedback, precum și un element de circuit ultra-sensibil.
În circumstanțe adecvate, buclele de feedback pozitiv și negativ pot oferi condiții pentru bistabilitate; de exemplu, datorită feedback-ului pozitiv asociat cu elementul de răspuns ultra-sensibil al circuitului. Un sistem bistabil histeretic poate acționa ca un comutator reversibil fiabil, deoarece este mai dificil pentru sistem să treacă între stările „pornit” și „oprit” (comparativ cu un răspuns hipersensibil monostabil echivalent). De asemenea, sistemul poate fi configurat astfel încât una dintre tranziții să fie inaccesabilă fizic; de exemplu, nicio cantitate de reducere a stimulului nu va readuce sistemul în starea „oprit” dacă este deja în starea „pornit”. Acest lucru va forma un comutator ireversibil de încredere. Modul de proiectare a unui comutator biologic simplu este descris într-o lucrare de conferință [10] .
Nu există o corespondență unu-la-unu între topologiile de rețea, deoarece multe rețele au relații similare de intrare și ieșire. Topologia rețelei nu implică intrare sau ieșire și, în mod similar, intrarea sau ieșirea nu implică topologia rețelei. Din acest motiv, parametrizarea este foarte importantă pentru funcționarea circuitului. Dacă dinamica intrării este comparabilă sau mai rapidă decât răspunsul sistemului, răspunsul poate părea histeretic.
Mai jos sunt descrise trei comutatoare ale ciclului celular care asigură tranziții bruște și/sau ireversibile prin utilizarea unora dintre mecanismele descrise mai sus.
Tranziția G1/S , mai bine cunoscută drept punctul de control în drojdia în devenire (punct de restricție la alte organisme), reglează cursul ciclului celular [1] . La acest punct de control, celulele fie se opresc înainte de replicarea ADN-ului (din cauza restricției de nutrienți sau a unui semnal de feromoni), prelungesc G1 (controlul mărimii), fie încep replicarea și trec prin restul ciclului celular. Rețeaua de reglementare G1/S sau regulon în drojdia în devenire include cicline G1 Cln1, Cln2 și Cln3, Cdc28 (Cdk1), factori de transcripție SBF și MBF și inhibitorul de transcripție Whi5 [2] . Cln3 interacționează cu Cdk1 pentru a iniția o secvență de evenimente prin fosforilarea unei game largi de ținte, inclusiv SBF, MBF și Whi5 . Fosforilarea lui Whi5 îl face să se miște din nucleu, împiedicând-o să fie inhibată de SBF și MBF. SBF/MBF activ conduce tranziția G1/S, inclusiv ciclinele de tip B și inițiază replicarea ADN-ului, formarea mugurilor și duplicarea fusului. Mai mult, SBF/MBF reglează expresia Cln1 și Cln2, care pot interacționa și cu Cdk1 pentru a promova fosforilarea țintelor sale.
Acest comutator G1/S a fost considerat inițial să funcționeze ca o secvență liniară de evenimente începând de la Cln3 și terminând la faza S [11] . Cu toate acestea, observația că oricare dintre Clns a fost suficient pentru a activa regulonul indică faptul că Cln1 și Cln2 pot fi capabili să folosească feedback pozitiv pentru a-și activa propria transcripție. Acest lucru ar avea ca rezultat un ciclu de accelerare constantă care ar putea acționa ca un flip-flop bistabil ireversibil [2] . Scotheim și colab. au folosit măsurători cu o singură celulă în drojdia în devenire pentru a arăta că acest feedback pozitiv apare într-adevăr [2] . O cantitate mică de Cln3 induce expresia Cln1/2, iar apoi intră în joc o buclă de feedback, ceea ce duce la o ieșire rapidă și bruscă a lui Whi5 din nucleu și, în consecință, la exprimarea coerentă a genelor regulon G1/S. În absența unei expresii genice coerente, celulele durează mai mult pentru a ieși din G1 și o proporție semnificativă se oprește chiar înainte de faza S, subliniind importanța feedback-ului pozitiv în îmbunătățirea comutatorului G1/S.
Punctul de control al ciclului celular G1/S controlează tranziția celulelor eucariote de la prima fază a decalajului G1 la faza de sinteză a ADN-ului, S. În această schimbare a celulelor de mamifere, există două kinaze ciclului celular care ajută la controlul punctului de control: ciclic celular kinazele CDK4/6-ciclina D și CDK2-ciclina E [1] . Un complex de transcripție care include Rb și E2F este important pentru controlul acestui punct de control. În prima fază de gol, complexul represor Rb-HDAC se leagă de factorii de transcripție E2F-DP1, inhibând astfel transcripția în aval. Fosforilarea Rb de către CDK4/6 și CDK2 disociază complexul Rb-represor și servește ca un comutator al ciclului celular. După fosforilarea Rb, inhibarea activității transcripționale a E2F este îndepărtată. Acest lucru permite transcrierea genelor din faza S care codifică proteine care îmbunătățesc trecerea G1 la faza S.
Mulți stimuli diferiți sunt utilizați pentru a controla punctele de control, inclusiv TGFb, deteriorarea ADN-ului, inhibarea contactului, îmbătrânirea replicativă și retragerea factorului de creștere. Primele patru acționează prin inducerea membrilor familiei INK4 sau Kip/Cip de inhibitori ai kinazei ciclului celular. TGFb inhibă transcripția Cdc25A, o fosfatază care activează kinazele ciclului celular, iar îndepărtarea factorului de creștere activează GSK3b, care fosforilează ciclina D. Aceasta duce la ubiquitinarea sa rapidă [12] .
G2 începe cu transcripția mediată de E2F a ciclinei A, care formează complexul ciclină A-Cdk2. Pentru a trece la mitoză, complexul ciclină B - Cdk1 (descoperit pentru prima dată ca factor care contribuie la MPF sau faza M; Cdk1 este cunoscut și sub numele de Cdc2 în drojdia de fisiune și Cdc28 în drojdia în devenire) este activat de Cdc25 , o proteină fosfatază [1] ] . Când începe mitoza, învelișul nuclear se dezintegrează, cromozomii se condensează și devin vizibili, iar celula se pregătește să se divizeze. Activarea ciclinei B -Cdk1 duce la distrugerea membranei nucleare, care este tipică pentru inițierea mitozei [1] .
Complexul ciclin B-Cdk1 este implicat într-un circuit reglator în care Cdk1 poate fosforila și activa activatorul său, Cdc25 (feedback pozitiv), și fosforilează și inactiva inactivatorul său, Wee1 kinaza (feedback negativ dublu) [1] . Acest circuit poate acționa ca un flip-flop bistabil [13] cu o stare staționară în G2 (Cdk1 și Cdc25 oprite, Wee1 pornit) și o a doua stare staționară în faza M (Cdk1 și Cdc25 active, Wee1 oprite). Cu toate acestea, Wee1 în sine este reglementat de alți factori, cum ar fi Cdr2 .
Acest lucru a fost propus și apărat de Jin și colab. [14] în seria lor de experimente cu linia celulară umană HeLa în 1998 a arătat că aranjamentul spațial al ciclinei B în interiorul celulei este cel care inițiază mitoza. După cum se știe din experimentele anterioare atât cu celule umane, cât și cu ovocite de stele de mare, Jin și colab. rezumă că ciclina B1 este abundentă în citoplasmă în timpul fazelor nedivizoare ale mitozei, dar este identificată în nucleu în complex cu Cdk1 chiar înainte ca celula să intre în mitoză. Alți experimentatori au arătat că celulele nu se vor diviza dacă ciclina B rămâne în citoplasmă. Pentru a investiga în continuare efectul poziției spațiale a ciclinei B asupra diviziunii celulare și controlului ciclului, Jin și colab. a marcat ciclina B cu un semnal de localizare nucleară (NLS), care menține ciclina în interiorul nucleului. Inițial, această ciclină B NLS nu a produs efectul așteptat de intrare accelerată în mitoză. Acest rezultat se datorează inhibiției prezentate în figura de mai jos. Wee1, un inhibitor al complexului ciclin B-Cdk1, este localizat în nucleu și probabil fosforilează ciclina B NLS, făcându-l incapabil să funcționeze conform intenției. Acest postulat a fost confirmat când Jin și colab. a folosit Cdc2AF, un mutant nefosforilat al Cdk1 și a observat intrarea accelerată în diviziunea celulară datorită localizării nucleare a ciclinei B. Prin urmare, localizarea nucleară a ciclinei B este necesară, dar nu suficientă pentru a declanșa diviziunea celulară.
Într-un studiu al reglării ciclului celular, Jin și colab. celule manipulate pentru a evalua localizarea ciclinei B în celulele cu leziuni ale ADN-ului. Printr-o combinație de deteriorarea ADN-ului și localizarea nucleară a ciclinei B exogene, ei au putut determina că celulele s-ar împărți chiar și cu deteriorarea ADN-ului dacă ciclina B ar fi forțată să fie exprimată în nucleu. Acest lucru indică faptul că localizarea spațială a ciclinei B poate juca rolul unui punct de control al mitozei. Dacă celulele nu se divid în mod normal atunci când informația lor genetică este deteriorată, dar intră în mitoză dacă ciclina B endogenă este exprimată în nucleu, este probabil ca translocarea ciclinei B în citoplasmă să fie mecanismul care împiedică intrarea mitotică imatură. Această ipoteză a fost confirmată în continuare de Jin și colab. Analiza celulelor reținute în G2 din cauza deteriorării ADN-ului. În aceste celule, Jin și colab. au observat niveluri ridicate de activitate a complexului ciclin B-Cdc2 în citoplasmă. Acest lucru confirmă teoria menționată anterior, deoarece arată că Cdc2 poate activa ciclina fără translocare imediată în nucleu. În plus, acumularea de complexe de ciclină B-Cdk1 în citoplasma celulelor care nu se divid din cauza leziunilor ADN susține teoria conform căreia localizarea nucleară a ciclinei B este cea care inițiază intrarea mitotică.
Astfel, localizarea spațială a ciclinei B joacă un rol în intrarea în mitoză. Translocarea ciclinei B din citoplasmă în nucleu este necesară pentru diviziunea celulară, dar nu este suficientă, deoarece inhibitorii săi nu permit celulei să intre prematur în mitoză. În plus față de rezervarea inhibării complexului ciclin B-Cdk1, diviziunea celulară prematură este prevenită prin translocarea ciclinei B în sine. Complexul ciclină B-Cdk1 va rămâne în citoplasmă în celulele cu leziuni ale ADN-ului, mai degrabă decât să se deplaseze către nucleu, prevenind celula de a inhiba intrarea celulei în mitoză. Următoarea întrebare adresată de cercetătorii din acest domeniu este ce mecanism specific reglementează această translocare.
Santos și colaboratorii [15] au sugerat că translocarea ciclinei B este reglată de un mecanism de feedback pozitiv similar cu cel care reglează activarea complexului ciclină B-Cdk1. Ei credeau că o buclă de feedback pozitiv implică fosforilarea ciclinei B și translocarea acesteia în nucleu. Pentru a începe să exploreze acest lucru, ei au confirmat mai întâi unele dintre rezultatele lui Jin și colab. experimente folosind imunofluorescența pentru a arăta ciclina B în citoplasmă înainte de divizare și translocarea în nucleu pentru a iniția mitoza, pe care au folosit-o, în comparație cu perturbarea învelișului nuclear (NEB). Folosind ciclina nucleară, care nu poate fi inactivată de Wee1 sau Myt1, Santos și colab. au observat că ciclina nucleară activă recrutează mai multă ciclină din citoplasmă pentru a se muta în nucleu. Ei au confirmat această observație prin utilizarea tratamentului iRap cu rapamicină. iRap induce translocarea ciclinei B marcate din citoplasmă la nucleu. În special, Santos și colab. am văzut că ciclina B nemarcată migrează cu ciclina B sub influența iRap. Ciclina nemarcată nu răspunde la tratament și se mișcă independent de ciclina tratată. Acest lucru confirmă prima parte a buclei de feedback pozitiv că localizarea nucleară a ciclinei B, care duce la intrarea mitotică, promovează translocarea crescută a ciclinei citoplasmatice B în nucleu, ceea ce facilitează și mai mult migrarea ciclinei citoplasmatice B rămase în nucleu etc. .
Santos și colab. sugerează în continuare că fosforilarea ciclinei B este o altă componentă a buclei de feedback pozitiv. Ei au observat că ciclina B intră în mod natural în nucleu înainte de NEB. În schimb, ciclina B mutantă, nefosforilată intră în nucleu în timpul NEB. Acest lucru este surprinzător, deoarece este caracteristic ciclului celular de a muta ciclina în nucleu înainte de NEB pentru a determina ciclul celular să progreseze în diviziune mitotică. Astfel, Santos et al. concluzionăm că fosforilarea ciclinei B promovează translocarea către nucleu. Cu toate acestea, în plus, translocarea în nucleu promovează fosforilarea ciclinei. Autorii notează că fosforilarea ciclinei B în nucleu este de nouăsprezece ori mai favorabilă decât în citoplasmă datorită volumului total mai mic al nucleului, care asigură o rată mai mare de fosforilare. Translocarea crescută datorită fosforilării și fosforilarea crescută datorită translocării ilustrează o buclă de feedback pozitiv care seamănă cu cea descoperită anterior care activează complexul ciclin B-Cdk1.
În concluzie, localizarea nucleară a ciclinei B este necesară pentru intrarea celulelor în mitoză. Translocarea ciclinei din citoplasmă în nucleu, care asigură diviziunea celulară, este reglată de o buclă de feedback pozitiv. Ciclina B activă se deplasează în nucleu și promovează activarea și mișcarea unităților suplimentare de ciclină situate în nucleu. Acest fenomen este sporit atunci când se ia în considerare fosforilarea. Fosforilarea ciclinei B promovează translocarea nucleară, iar ciclina B din nucleu este mult mai probabil să fie fosforilată, astfel încât localizarea nucleară favorizează, la rândul său, fosforilarea ciclinei B.
Odată ce celulele sunt în mitoză, ciclina B-Cdk1 activează complexul de stimulare a anafazei (APC), care, la rândul său, inactivează ciclina B-Cdk1 prin degradarea ciclinei B, ducând în cele din urmă la ieșirea din mitoză. Combinația funcției de răspuns bistabil a lui Cdk1 cu feedback negativ de la APC poate genera așa-numitul oscilator de relaxare [3] cu explozii ascuțite de activitate Cdk1 care declanșează cicluri mitotice stabile. Cu toate acestea, în oscilatorul de relaxare, parametrul de control se mișcă lent în raport cu dinamica răspunsului sistemului, care poate fi o reprezentare precisă a intrării mitotice, dar nu neapărat a ieșirii mitotice.
Este necesară inactivarea complexului ciclin B-Cdk1 pentru a ieși din stadiul mitotic al ciclului celular. Celulele se pot întoarce apoi la prima fază a decalajului G1 și pot aștepta până când ciclul continuă din nou.
În 2003, Pomerening et al. a oferit dovezi puternice pentru această ipoteză demonstrând histerezis și bistabilitate în activarea Cdk1 în extractele citoplasmatice ale ovocitelor Xenopus [3] . Ei au demonstrat mai întâi un răspuns de vârf intermitent al Cdk1 la o schimbare a concentrației de Ciclină B nedegradabilă (pentru a decupla rețeaua de răspuns Cdk1 de feedback-ul negativ mediat de APC). Cu toate acestea, un astfel de răspuns va corespunde atât unei tranziții supersensibile monostabile, cât și unei tranziții bistabile. Pentru a distinge între aceste două posibilități, ei au măsurat nivelurile la starea de echilibru ale Cdk1 activ ca răspuns la schimbarea nivelurilor de ciclină, dar în două experimente separate, unul a început cu un extract de interfază și celălalt a început cu un extract deja în mitoză. La concentrații intermediare de ciclină, au găsit două concentrații staționare de Cdk1 activ. Care dintre cele două stări de echilibru a fost ocupată a depins de istoria sistemului, adică dacă au început cu un extract de interfază sau mitotic, prezentând efectiv histerezis și bistabilitate.
În același an, Sha și colaboratorii [16] au ajuns în mod independent la aceeași concluzie prin găsirea unei bucle de histerezis folosind și extracte de ouă de Xenopus laevis. Trei predicții ale modelului Nowak-Tyson au fost testate în această lucrare pentru a concluziona că histerezisul este forța motrice din spatele „tranzițiilor ciclului celular în și din mitoză”. Predicțiile modelului Nowak-Tyson sunt comune pentru toate bifurcațiile punctului de șa. Bifurcațiile punctului de șa sunt extrem de utile într-o lume imperfectă, deoarece ajută la descrierea sistemelor biologice imperfecte. Prima predicție a fost că concentrația prag de ciclină pentru a intra în mitoză este mai mare decât concentrația de prag de ciclină pentru a ieși din mitoză, iar acest lucru a fost confirmat prin suplimentarea extractelor ciclice de ou cu ciclină B nedegradabilă și măsurarea pragului de activare și inactivare după adăugarea de cicloheximidă (CHX), care este un inhibitor al sintezei proteinelor [1] . În plus, a fost confirmată și a doua predicție a modelului Nowak-Tyson: acidul dezoxiribonucleic nereplicat sau ADN-ul crește concentrația prag de ciclină necesară pentru intrarea în mitoză. Pentru a ajunge la această concluzie, la extractele eliberate de factorul citostatic s-au adăugat CHX, APH (inhibitor de ADN polimerază) sau ambele și ciclina B nedegradabilă. A treia și ultima predicție care a fost testată și confirmată în acest articol a fost aceea că rata de activare a Cdc2 încetinește în apropierea concentrației de prag de activare a ciclinei. Aceste predicții și experimente demonstrează un comportament de comutare similar cu comutarea, care poate fi descris prin histerezis într-un sistem dinamic [17] .
În timpul trecerii de la metafază la anafază , este extrem de important ca cromatidele surori să se separe corect și simultan în capete opuse ale celulei [1] . Separarea cromatidelor surori este inițial puternic inhibată pentru a preveni separarea prematură în mitoza târzie, dar această inhibare este atenuată prin distrugerea elementelor inhibitoare de către complexul de stimulare a anafazei (APC) odată ce se obține biorientarea cromatidei surori. Un astfel de element inhibitor este securina , care previne distrugerea coezinei , complexul care ține cromatidele surori împreună, prin legarea la o protează separatază , care vizează Scc1 , o subunitate a complexului de coezină, pentru distrugere . În acest sistem , fosfataza Cdc14 poate elimina fosfatul inhibitor din securină, facilitând astfel descompunerea securinei APC prin eliberarea separazei. După cum arată Uhlmann și colab., în timpul atașării cromozomilor la fusul mitotic, cromatidele rămân în perechi, deoarece legarea între surori împiedică separarea [8] [18] . Coeziunea se stabilește în timpul replicării ADN-ului și depinde de coezina, care este un complex multi-subunități format din Scc1, Scc3, Smc2 și Smc3. În drojdie, în timpul tranziției de la metafază la anafază, Scc1 se disociază de cromozomi, iar cromatidele surori se separă. Această acțiune este controlată de proteina Esp1, care este strâns legată de inhibitorul anafazei Pds1, care este degradat de complexul de stimulare a anafazei. Pentru a verifica că Esp1 joacă într-adevăr un rol în reglarea asocierii cromozomilor Scc1, tulpinile celulare au fost oprite la G1 cu factor alfa. Aceste celule au rămas în stare de oprire în timpul dezvoltării. Au fost utilizate celule Esp1-1 mutante și experimentul a fost repetat, cu Scc1 legându-se cu succes de cromozomi și rămânând asociat chiar și după încetarea sintezei. Acest lucru a fost important pentru a demonstra că, cu Esp1, capacitatea lui Scc1 de a deveni asociat stabil cu cromozomii în timpul G1 este împiedicată, iar Esp1 poate elimina Scc1 direct din cromozomi.
Acest lucru a fost demonstrat de Holt et al. [4] că separaza activează Cdc14, care la rândul său acționează asupra securinei, creând astfel o buclă de feedback pozitiv care îmbunătățește claritatea tranziției de la metafază la anafază și coordonarea separării cromatidelor surori [19] . Holt și colab. au investigat baza efectului de feedback pozitiv asupra fosforilării securinei folosind tulpini mutante de drojdie de securină și au testat modul în care schimbările în reglarea fosforului securinei afectează sincronia separării cromatidelor surori. Rezultatele lor indică faptul că interferența cu această buclă pozitivă securin-separase-cdc14 reduce sincronia separării cromatidelor surori. Acest feedback pozitiv ar putea genera ipotetic bistabilitate la tranziția la anafază, determinând celula să ia o decizie ireversibilă de a separa cromatidele surori.
Ieșirea din mitoză este un punct important de tranziție care marchează sfârșitul mitozei și începutul unei noi faze G1 pentru celulă, iar celula trebuie să se bazeze pe mecanisme de control specifice, astfel încât, după ieșirea din mitoză, să nu revină niciodată în mitoză până când nu este. complet. A trecut etapele G1, S și G2 și a trecut toate punctele de control necesare. Mulți factori, inclusiv cicline , kinaze dependente de ciclină (CDK), ligaze ubiquitin , inhibitori ai kinazelor dependente de ciclină și fosforilarea reversibilă , reglează ieșirea mitotică pentru a se asigura că evenimentele ciclului celular apar în ordinea corectă cu cele mai puține erori [20] . Sfârșitul mitozei se caracterizează prin dezintegrarea fusului, scurtarea microtubulilor kinetocori și creșterea pronunțată a microtubulilor astrali (nonkinetocori) [21] . Pentru o celulă eucariotă normală, ieșirea din mitoză este ireversibilă [22] .
Au fost făcute multe sugestii cu privire la mecanismele de control utilizate de celulă pentru a asigura ireversibilitatea ieșirii din mitoză într-un organism eucariot model, drojdia în devenire Saccharomyces cerevisiae . Degradarea proteolitică a regulatorilor ciclului celular și efectul corespunzător asupra nivelurilor kinazelor dependente de ciclină au fost propuse ca un mecanism care promovează ciclul celular eucariotic și, în special, trecerea de la metafază la anafază. În această teorie, complexul de stimulare a anafazei (APC), o clasă de ubiquitin ligaze, promovează degradarea ciclinelor mitotice (Clb2) și a factorilor inhibitori ai anafazei (PDS1, CUT2) pentru a promova ieșirea mitotică [23] . APC ubiquitinează un motiv de nouă aminoacizi cunoscut sub numele de cutie de perturbare (D-box) în domeniul NH2-terminal al ciclinelor mitotice pentru degradarea proteazomului [23] . APC în asociere cu Cdc20 (APC-Cdc20) ubiquitinează și vizează ciclinele mitotice (Clb2) pentru degradare în faza inițială. Simultan, APC-Cdc20 mediază degradarea securinelor, care inhibă separatele prin legarea timpurie în anafaza. Separaza eliberată și activă scindează cohesina, care ține cromatidele surori împreună, facilitând separarea cromatidelor surori și inițiind ieșirea mitotică, promovând eliberarea de Cdc14 din nucleol [24] [25] . Într-o fază ulterioară, reglarea în jos a Cdk1 și activarea Cdc14, o fosfatază de activare a Cdh1, promovează formarea APC în asociere cu Cdh1 (APC-Cdh1) pentru a degrada Clb2 [22] . Cdc20 și Cdh1, care sunt activatori APC, recrutează substraturi precum securina și ciclinele de tip B (Clb) pentru ubiquitinare [26] . Fără complexe Cdk1-Clb2 pentru fosforilarea proteinelor care sunt implicate în dinamica fusului, precum Sli15, Ase1 și Ask1 , sunt asigurate alungirea fusului și segregarea cromozomială, facilitând ieșirea din mitoză [22] . Importanța degradării proteolitice în ciclul celular eucariotic a schimbat viziunea diviziunii celulare ca o simplă cascadă de kinaze într-un proces mai complex care necesită interacțiuni între fosforilare, ubiquitinare și proteoliză [23] . Cu toate acestea, experimentele care utilizează celule de drojdie în devenire cu cdc28-as1, o alelă Cdk sensibilă la INM-PP1 (analog ATP), au dovedit că distrugerea ciclinelor de tip B (Clb) nu este necesară pentru a declanșa ieșirea ireversibilă din mitoză [22] . Degradarea Clb2 scurtează perioada de inhibare a Cdk1 necesară pentru a declanșa ieșirea mitotică ireversibilă, ceea ce indică faptul că proteoliza ciclinei contribuie la natura dinamică a ciclului celular eucariotic datorită timpului său mai lent de acțiune, dar este puțin probabil să fie principalul determinant în declanșarea unui ireversibil. ciclu celular.. tranziții [22] .
Au fost făcute descoperiri care indică importanța nivelului de inhibitori ai kinazelor dependente de ciclină în reglarea ciclului celular eucariote. În special, s-a demonstrat că nivelul de Sic1 , un inhibitor stoechiometric al complexelor Clb-CDK din drojdia înmugurire, este deosebit de important pentru tranziția ireversibilă G1-S datorită activării ireversibile a kinazelor de faza S [27] . S-a demonstrat că nivelul Sic1 joacă un rol important în declanșarea ieșirii ireversibile din mitoză (tranziția M-G1), precum și în tranziția G1-S. În timpul mitozei, o scădere a nivelurilor de Cdk1 duce la activarea Cdc14, o fosfatază care contracarează Cdk1 prin activarea Cdh1 și Swi5, un activator transcripțional al proteinelor Sic1 [28] . În timp ce degradarea Sic1 la un anumit nivel scăzut a declanșat faza S, acumularea de Sic1 la un anumit nivel ridicat a fost necesară pentru a declanșa ieșirea ireversibilă din mitoză [22] . Inhibitorii Cdk1 pot induce ieșirea mitotică chiar și atunci când degradarea ciclinelor de tip B este blocată de expresia Clbs nedegradabili sau inhibitori de proteazom. Cu toate acestea, cromatidele surori nu reușesc să se segreze și celulele revin la mitoză după ce inhibitorii sunt spălați, ceea ce indică faptul că trebuie atins un nivel de prag al inhibitorilor pentru a declanșa ieșirea mitotică ireversibilă, independent de degradarea ciclinei [29] . În ciuda diferitelor praguri ale nivelului Sic1 necesare pentru a declanșa ieșirea mitotică în comparație cu tranziția G1-S, s-a demonstrat că nivelul Sic1 joacă un rol cheie în reglarea ciclului celular eucariotic prin inhibarea activității CDK.
Deoarece ciclul celular eucariote implică multe proteine și interacțiuni de reglementare, o abordare a sistemelor dinamice poate fi utilizată pentru a simplifica un lanț biologic complex într-o structură comună pentru o analiză mai bună [30] . Printre cele patru relații posibile de intrare/ieșire, relația dintre nivelul Sic1 și ieșirea mitotică pare să prezinte caracteristici ale unui comutator bistabil ireversibil condus de feedback între APC-Cdh1, Sic1 și Clb2-Cdk1 [22] . Bistabilitatea este cunoscută pentru controlul funcțiilor biologice, cum ar fi controlul ciclului celular și diferențierea celulară și joacă un rol cheie în multe rețele de reglare celulară [31] . O conexiune de intrare/ieșire bistabilă este caracterizată de două stări stabile cu două puncte de bifurcație. Sunt posibile ieșiri multiple pentru o anumită intrare în regiunea de bistabilitate marcată de două puncte de bifurcație. În plus, cuplarea bistabilă prezintă histerezis: starea/ieșirea finală depinde de istoricul intrării, precum și de valoarea curentă a intrării, deoarece sistemul are o memorie [32] . Un punct de bifurcație are o valoare negativă a parametrului de control (punctul de bifurcație este pe cealaltă parte a axei), ceea ce duce la un decalaj între cele două stări stabile și ireversibilitatea trecerii de la o stare la alta. În ceea ce privește ieșirea din mitoză, cele două stări stabile sunt determinate de mitoză și faza G1. Odată ce nivelul Sic1 (intrare) depășește pragul, are loc o tranziție ireversibilă de la mitoză (starea stabilă I) la faza G1 (starea stabilă II). Într-un mediu imperfect, singura bifurcație care rămâne neschimbată este bifurcația nodului șa . Bifurcația nod-șa nu este încălcată (nodul-șa este comportamentul general așteptat), în timp ce bifurcațiile transcritice și furcă nu sunt încălcate în prezența imperfecțiunilor [33] . Astfel, singura bifurcație unidimensională care poate exista într-o lume biologică imperfectă este bifurcația nodului șa [32] . Legătura bistabilă dintre tranziția M-G1 și nivelul Sic1 poate fi reprezentată ca o diagramă a două bifurcații nod șa, în care comportamentul sistemului se modifică calitativ cu o mică modificare a parametrului de control, valoarea lui Sic1.
Deoarece comportamentul ciclului celular este dependent în mod critic de cantitatea de Sic1 în starea de tranziție M-G1, cantitatea de Sic1 este strâns reglementată de feedback la nivel de sistem. Deoarece Cdk1-Clb2 inhibă Sic1 prin fosforilarea Sic1 și făcând Sic1 disponibil pentru degradare prin ubiquitinare, degradarea dependentă de APC-Cdh1 a Cdk1-Clb2 nu numai că reduce nivelul de complexe Cdk1-Clb2 disponibile, dar crește și nivelul de Sic1, care în mai departe inhibă mai mult funcția Cdk1-Clb2 [28] . Această activare dublă a buclei de feedback negativ este inițiată de degradarea dependentă de APC-Cdc20 a Cdk1-Clb2 și eliberarea de Cdc14 din proteina nucleolară Net1/Cfi1 [34] . Calea FEAR (eliberare timpurie anafazată a Cdc14) facilitează fosforilarea Net1 dependentă de Clb2-Cdk1, care eliberează tranzitoriu Cdc14 din Net1 [35] . Complexele Cdc14 și Clb2-Cdk1 eliberate trec în fus, care activează rețeaua de ieșire a mitozei (MEN). MEN asigură eliberarea susținută de Cdc14 din nucleol [35] și Cdc14 contracarează activitatea Clb2-Cdk1 prin activarea Cdh1 și stabilizarea Sic1 prin activarea activatorului transcripțional Sic1 Swi5 [36] . Sic1 se reglează pozitiv prin inhibarea Cdk1-Clb2 pentru a elibera inhibarea Swi5, iar Cdh1, de asemenea, se reglează pozitiv prin inhibarea Clb2-Cdk1 pentru a elibera inhibiția MEN, care poate activa Cdc14 și apoi Cdh1 însuși. Bucla dublă de feedback negativ formată de APC-Cdh1 și Sic1 este necesară pentru a menține o activitate scăzută a Clb2-Cdk1, deoarece Clb2 își activează automat sinteza prin activarea factorilor de transcripție, complexul Fkh2-Mcm1 Ndd1 [ 28] .
Ciclul celular eucariote este alcătuit din diferite puncte de control și bucle de feedback pentru a asigura diviziunea celulară corectă și de succes. De exemplu, în timpul mitozei, când cromozomii duplicați sunt atașați necorespunzător de fusul mitotic, proteinele punct de control al ansamblului fusului (SAC), inclusiv Mad și Bub, inhibă APC-Cdc20, întârziend intrarea în anafaza și degradarea ciclinei de tip B. În plus, atunci când fusurile mitotice sunt deplasate, MEN și, ulterior, Cdc14 sunt inhibate de Bub2 și Bfa1-dependent pentru a preveni degradarea ciclinelor mitotice și intrarea în anafaza [36] . Sic1 este un bun exemplu al modului în care buclele de feedback la nivel de sistem interacționează pentru a detecta condițiile de mediu și pentru a declanșa tranzițiile ciclului celular. Deși tranziția actuală M-G1 este extrem de complexă, implicând multe proteine și reglementări, abordarea sistemelor dinamice ne permite să simplificăm acest sistem complex la o relație bistabilă de intrare/ieșire cu două bifurcații nodului șa în care ieșirea (ieșirea mitotică) depinde de concentrare critică. Sic1. Folosind analiza univariată, s-ar putea explica numeroasele puncte de tranziție ireversibile din ciclul celulei eucariote care sunt reglementate prin control și feedback la nivel de sistem. Alte exemple de puncte de tranziție ireversibile includ Start (un angajament ireversibil față de un nou ciclu de diviziune celulară), care poate fi explicat printr-un comutator bistabil ireversibil, al cărui parametru de control este strâns reglementat de feedback-urile sistemului, inclusiv Cln2, Whi5 și SBF . 37] .
| ciclul celulei | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| faze |
| ||||||||||
| Regulatoare |
| ||||||||||