Vectorii virali sunt instrumente utilizate în mod obișnuit de biologii moleculari pentru a furniza material genetic în celule . Acest proces poate fi efectuat în interiorul unui organism viu ( in vivo ) sau în cultură celulară ( in vitro ). Virușii au mecanisme moleculare specializate pentru a-și transporta eficient genomul în celulele pe care le infectează. Livrarea genelor sau a altui material genetic de către un vector se numește transducție , iar celulele infectate sunt descrise ca fiind transduse. Biologii moleculari au folosit pentru prima dată acest mecanism în anii 1970. Paul Berg a folosit un SV40 modificat care conținea ADN bacteriofag λ pentru a infecta celulele de rinichi de maimuță cultivate [1] .
Pe lângă utilizarea lor în cercetarea în biologie moleculară, vectorii virali sunt utilizați pentru terapia genică și dezvoltarea vaccinurilor .
Vectorii virali sunt adaptați aplicației lor specifice, dar de obicei au câteva proprietăți cheie.
Vectorii virali au fost inițial dezvoltați ca o alternativă la transfecția ADN-ului nativ pentru experimente de genetică moleculară . În comparație cu metodele tradiționale, cum ar fi precipitarea cu fosfat de calciu, transducția poate asigura că aproape 100% din celule sunt infectate fără a afecta grav viabilitatea celulelor. În plus, unii viruși se integrează în genomul celulei , promovând expresia stabilă.
Proteinele codificate de gene pot fi exprimate folosind vectori virali, de obicei pentru a studia funcția unei anumite proteine. Vectorii virali, în special retrovirușii, care exprimă stabil gene marker, cum ar fi GFP , sunt folosiți pe scară largă pentru a marca permanent celulele pentru a le urmări și a urmașilor lor, cum ar fi în experimentele de xenotransplant , în care celulele infectate in vitro sunt implantate într-un animal gazdă.
Inserarea genelor este mai ieftină decât knockout-ul genei . Dar acest lucru dă rezultate mai puțin fiabile, deoarece uneori este nespecific și are efecte în afara țintă asupra altor gene. Vectorii animale gazdă joacă, de asemenea, un rol important.
Terapia genică este o metodă de corectare a genelor defecte responsabile de dezvoltarea unei boli. În viitor , terapia genică poate oferi o modalitate de a trata tulburările genetice , cum ar fi imunodeficiența combinată severă , fibroza chistică sau chiar hemofilia A. Deoarece aceste boli rezultă din mutații ale secvenței ADN pentru anumite gene, studiile de terapie genică au folosit viruși pentru furnizează copii de tip sălbatic ale acestor gene în celulele corpului pacientului. A existat o cantitate imensă de succes în laborator cu terapia genică. Cu toate acestea, mai multe probleme cu terapia genică virală trebuie depășite înainte ca aceasta să fie utilizată pe scară largă. Răspunsul imun la viruși nu numai că împiedică livrarea genelor către celulele țintă, dar poate provoca complicații grave pentru pacient. Într-unul dintre studiile timpurii de terapie genetică din 1999, aceasta a dus la moartea lui Jesse Gelsinger , care a fost tratat cu un vector adenoviral. [2]
Unii vectori virali, cum ar fi retrovirusurile gamma, își introduc genomul într-o locație aparent aleatorie pe unul dintre cromozomii gazdei , ceea ce poate perturba funcția genei celulare și poate duce la cancer. În 2002, într-un studiu sever combinat de terapie genetică retroviral cu imunodeficiență , patru pacienți au dezvoltat leucemie ca urmare a tratamentului; [3] trei pacienți s-au recuperat după chimioterapie. [4] Vectorii bazați pe viruși adeno-asociați sunt mult mai siguri în acest sens, întrucât se integrează întotdeauna în același loc în genomul uman, fiind folosiți în diverse afecțiuni precum boala Alzheimer [5] .
Virusurile care exprimă proteine patogene sunt în prezent dezvoltate ca vaccinuri împotriva acestor agenți patogeni, pe baza aceleiași rațiuni ca și vaccinurile ADN . Limfocitele T recunosc celulele infectate cu paraziți intracelulari pe baza proteinelor străine produse în celulă. Imunitatea celulelor T este esențială pentru protecția împotriva infecțiilor virale și a bolilor precum malaria . Vaccinul viral induce expresia proteinelor patogene în celulele gazdă într-o manieră similară cu vaccinul poliomielitei al lui Sabin și cu alte vaccinuri atenuate. Cu toate acestea, deoarece vaccinurile virale conțin doar o mică parte din genele agentului patogen, ele sunt mult mai sigure și nu este posibilă infecția sporadică de către agentul patogen.
În secolul XXI, vaccinurile bazate pe vectori de adenovirus sunt dezvoltate în mod activ [6] .
Retrovirusurile sunt unul dintre fundamentele abordărilor moderne de terapie genetică. Retrovirusurile recombinante, cum ar fi virusul leucemiei murine Moloney, sunt capabile să se integreze stabil în genomul gazdei. Acestea conțin transcriptază inversă pentru a crea o copie ADN a genomului ARN și integraza, care permite integrarea în genomul gazdă . Acestea au fost utilizate într-un număr de studii clinice aprobate de FDA, cum ar fi studiul SCID-X1 [7] .
Vectorii retrovirali pot fi fie competenți la replicare, fie defecti de replicare. Vectorii cu deficit de replicare sunt cea mai comună alegere în cercetare, deoarece virușii au regiunile de codificare pentru genele necesare pentru runde suplimentare de replicare și ambalarea virionilor înlocuite cu alte gene sau șterse. Acești viruși sunt capabili să infecteze celulele țintă și să livreze sarcina utilă virală, dar apoi nu pot continua calea litică tipică care duce la liza și moartea celulelor.
În schimb, vectorii virali competenți de replicare conțin toate genele necesare pentru sinteza virionilor și continuă să prolifereze de îndată ce apare infecția. Deoarece genomul viral pentru acești vectori este mult mai lung, lungimea genei de interes inserată reală este limitată în comparație cu lungimea posibilă a inserției pentru vectorii cu defecte de replicare. În funcție de vectorul viral, lungimea maximă tipică a unei inserții ADN valide într-un vector viral defect de replicare este de obicei de aproximativ 8-10 kB. [8] Deși acest lucru limitează introducerea multor secvențe genomice, cele mai multe secvențe de ADNc pot fi încă găzduite.
Principalul dezavantaj al utilizării retrovirusurilor precum retrovirusul Moloney este necesitatea diviziunii celulare active pentru transducție . Ca rezultat, celulele precum neuronii sunt foarte rezistente la infecție și transducție de către retrovirusuri.
Există îngrijorarea că mutageneza inserțională datorată integrării în genomul gazdei poate duce la cancer sau leucemie . Această problemă a rămas teoretică până când terapia genică pentru zece pacienți cu SCID-X1 folosind virusul leucemiei la șoarece Maloney [9] a dus la două cazuri de leucemie cauzate de activarea oncogenei LMO2 datorită integrării strânse a vectorului. [zece]
Lentivirusurile sunt o subclasă de retrovirusuri. Aceștia sunt uneori folosiți ca vectori de terapie genetică datorită capacității lor de a se integra în genomul celulelor care nu se divizează, ceea ce este unic pentru lentivirusuri, deoarece alți retrovirusuri pot infecta doar celulele în diviziune. Genomul viral, sub formă de ARN , suferă transcripție inversă atunci când virusul intră în celulă pentru a produce ADN , care este apoi inserat în genom într-o poziție aleatorie (descoperirile recente sugerează de fapt că inserarea ADN-ului viral nu este întâmplătoare, ci este direcționat către gene active specifice și asociat cu organizarea genomului [11] ) de către o enzimă integrază virală . Vectorul, numit acum provirus , rămâne în genom și este transmis descendenților celulei atunci când se împarte. Site-ul de integrare este imprevizibil, ceea ce poate crea o problemă. Provirusul poate perturba funcția genelor celulare și poate duce la activarea oncogenelor care promovează cancerul , ridicând îngrijorări cu privire la posibila utilizare a lentivirusurilor în terapia genică. Cu toate acestea, studiile au arătat că vectorii lentivirali au o tendință mai mică de a se integra în locurile care pot provoca cancer decât vectorii gamma-retrovirali. [12] Mai precis, un studiu a arătat că vectorii lentivirali nu au cauzat nici o creștere a incidenței tumorilor, nici un debut mai devreme al tumorilor la șoareci cu o incidență semnificativ mai mare a tumorilor. [13] În plus, nu a fost observată nicio creștere a evenimentelor mutagene sau oncologice în studiile clinice care au folosit vectori lentivirali pentru a oferi terapie genică pentru tratamentul HIV.
Din motive de siguranță, vectorii lentivirali nu poartă niciodată genele necesare pentru replicarea lor. Pentru a obține lentivirus, mai multe plasmide sunt transfectate într-o așa-numită linie celulară de ambalare, de obicei HEK 293 . Una sau mai multe plasmide, denumite în mod obișnuit plasmide de ambalare, codifică proteine virion , cum ar fi capsidul și transcriptaza inversă . Cealaltă plasmidă conține materialul genetic care va fi eliberat de vector. Este transcris pentru a produce genomul viral de ARN monocatenar și este marcat de prezența secvenței ψ (psi). Această secvență este utilizată pentru a împacheta genomul într-un virion.
Spre deosebire de lentivirusuri, ADN-ul adenoviral nu se integrează în genom și nu se reproduce în timpul diviziunii celulare. Acest lucru limitează utilizarea lor în cercetarea de bază, deși vectorii adenovirali sunt încă utilizați în experimente in vitro , precum și in vivo . [14] Utilizarea lor principală este în terapia genică și vaccinare [15] [16] . Acesta este modul în care adenovirusul uman este utilizat pentru vaccinul Sputnik V. Deoarece oamenii vin în mod obișnuit în contact cu adenovirusuri care provoacă infecții respiratorii, gastrointestinale și oculare, majoritatea pacienților au dezvoltat deja anticorpi neutralizanți care pot inactiva virusul înainte de a ajunge la celula țintă. Pentru a depăși această problemă, oamenii de știință investighează în prezent adenovirusurile care infectează diferite specii față de care oamenii nu au imunitate.
Virusul adeno-asociat (AAV) este un virus mic care infectează oamenii și alte specii de primate. În prezent se știe că AAV nu provoacă boală și provoacă un răspuns imun foarte slab. AAV poate infecta atât celulele în diviziune cât și cele care nu se divizează și poate încorpora genomul său în genomul celulei gazdă. Mai mult, AAV rămâne în cea mai mare parte episomal (replicare fără includere în cromozom); împlinind o expresie lungă și stabilă. [17] Aceste caracteristici fac AAV un candidat foarte atractiv pentru dezvoltarea vectorilor virali pentru terapia genică. [1] Cu toate acestea, AAV poate aduce doar până la 5 KB, ceea ce este semnificativ mai mic decât capacitatea inițială a AAV. [17]
În plus, datorită utilizării sale potențiale ca vector de terapie genică, cercetătorii au creat un AAV modificat numit virus adeno-asociat auto-suplimentar (scAAV). În timp ce AAV împachetează o catenă de ADN și necesită un proces de sinteză a a doua catenă, scAAV împachetează ambele catene, care sunt coapte împreună pentru a forma ADN dublu catenar. Omitând sinteza a doua catene, scAAV permite exprimarea rapidă în celulă. [18] În caz contrar, scAAV împărtășește multe dintre caracteristicile omologului său AAV.
Vectorii hibrizi sunt viruși vectori care sunt modificați genetic pentru a avea proprietățile mai multor vectori. Virușii sunt modificați pentru a evita deficiențele vectorilor virali tipici, care pot avea o capacitate de încărcare limitată, imunogenitate, genotoxicitate și pot să nu suporte expresia transgenă adecvată pe termen lung . Prin înlocuirea elementelor nedorite cu abilități dezirabile, vectorii hibrizi pot depăși în viitor vectorii standard de transfecție în ceea ce privește siguranța și eficacitatea terapeutică. [19]
Alegerea unui vector viral pentru a furniza material genetic în celule este asociată cu unele probleme logistice. Există un număr limitat de vectori virali disponibili pentru uz terapeutic. Oricare dintre acești câțiva vectori virali poate provoca un răspuns imun de la gazdă dacă vectorul este privit ca un invadator străin. [20] [21] Odată utilizat, vectorul viral nu poate fi utilizat din nou eficient la un pacient deoarece va fi recunoscut de organism. Dacă un vaccin sau o terapie genetică eșuează studiile clinice , virusul nu poate fi utilizat din nou la un pacient pentru un alt vaccin sau terapie genică în viitor. Imunitatea preexistentă împotriva vectorului viral poate fi de asemenea prezentă la pacient, făcând terapia ineficientă pentru acel pacient. [20] [22] Este posibilă contracararea imunității preexistente atunci când se utilizează un vector viral pentru vaccinare prin amorsarea cu un vaccin ADN non-viral , dar această metodă prezintă o altă problemă și obstacol în procesul de distribuție a vaccinului. [23] Imunitatea existentă poate fi, de asemenea, contestată prin creșterea dozei de vaccin sau prin schimbarea căii de vaccinare . [24] Unele dezavantaje ale vectorilor virali (cum ar fi genotoxicitatea și expresia scăzută a transgenelor) pot fi depășite folosind vectori hibrizi.