Evoluția sistematică a liganzilor prin îmbogățire exponențială ( în engleză SELEX din Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment ) este o metodă de chimie combinatorie utilizată în biologia moleculară pentru a obține oligonucleotide (molecule scurte de ARN sau ADN monocatenar ) care se leagă în mod specific la un anumit ligand (sau liganzi). Astfel de oligonucleotide sunt numite aptameri [1] [2] [3] . Cel mai adesea, această metodă se numește SELEX, dar există și abrevieri SAAB (din engleză. select and amplified binding site - selected and amplified binding site ) și CASTing (din engleză cyclic amplification and selection of targets - cyclic amplification and selection of targets) [4] [5] . SELEX a fost dezvoltat în 1990. În 2015, Journal of Molecular Evolution a dedicat acestei metode un număr special în legătură cu aniversarea a 25 de ani de la inventarea sa [6] .
Procesul începe cu sinteza unei biblioteci foarte mari de oligonucleotide , constând din secvențe aleatoare de lungime fixă cu regiuni constante 5’ și 3’ care servesc ca situsuri de recoacere a primerului (adică legarea complementară a primerilor la matriță). În plus, oligonucleotidele incluse în bibliotecă interacționează cu ligandul de interes pentru cercetător (cel mai adesea o proteină sau un compus organic mic ). Acele oligonucleotide care nu s-au putut lega de ligand sunt îndepărtate folosind cromatografia de afinitate sau granule magnetice [7] . Oligonucleotidele legate de ligand sunt eluate, amplificate prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) și supuse rundelor ulterioare de selecție pentru a selecta molecule cu cea mai mare afinitate pentru ligand [2] [3] .
Metoda SELEX a fost deja folosită cu succes pentru a dezvolta un număr de aptameri în scopuri clinice și de cercetare [8] . SELEX a fost, de asemenea, utilizat pentru a genera aptameri cu nucleotide care conțin zaharuri modificate chimic sau baze azotate . Nucleotidele modificate pot oferi aptamerilor capacități suplimentare de legare și, de asemenea, le pot crește stabilitatea [9] .
Primul pas al SELEX este crearea unei biblioteci mari de oligonucleotide cu o lungime fixă, dar secvențe complet sau parțial aleatorii. Cu toate acestea, regiunile cu o secvență variabilă trebuie să fie flancate de regiuni cu o secvență fixă pentru a fi amplificate prin PCR. Oligonucleotidele sunt inițial preparate prin sinteză chimică și apoi amplificate prin PCR, astfel încât fiecare secvență aleatorie să fie prezentă în mai multe copii în bibliotecă. În cazul aptamerilor ARN, se realizează transcripția in vitro a secvențelor aleatorii. Numărul mare de copii al fiecărei secvențe aleatoare reduce probabilitatea ca un site potențial de legare să se piardă din motive stocastice. Pentru ca oligonucleotidele să poată dobândi o structură spațială nativă, acestea sunt transformate într-o formă monocatenară și abia după aceea sunt incubate cu ligand țintă [2] [3] [10] .
Imediat înainte de adăugarea oligonucleotidelor la ligand, biblioteca de oligonucleotide monocatenar este încălzită și răcită lent, astfel încât acestea să dobândească o structură secundară și terțiară stabilă termodinamic [3] [7] . Biblioteca de secvențe aleatoare (bibliotecă randomizată) este apoi incubată cu ligand țintă imobilizat pentru a permite aptamerilor să se lege la acesta. Protocoalele pentru incubarea unei biblioteci cu un ligand pot varia, în special, diferite abordări pentru imobilizarea liganzilor, separarea oligonucleotidelor nelegate, timpi și temperaturi diferiți de incubare , tampon de incubare și rapoarte de concentrație ale oligonucleotidelor și liganzilor. Liganzii sunt imobilizați pe coloane de cromatografie de afinitate [3] , filtre de nitroceluloză [2] sau granule magnetice [7] . De asemenea, a fost dezvoltată o variantă de SELEX care utilizează întreaga celulă ca ligand . În acest caz, incubarea bibliotecii de oligonucleotide are loc direct în vasele de cultură în care cresc celulele [11] . Compoziția tamponului în care are loc incubarea depinde de proprietățile ligandului și de cerințele pentru aptameri selectați cu succes. De exemplu, dacă ligandul este o moleculă mică sau o proteină încărcată negativ , se utilizează tampoane cu sare mari pentru a promova legarea aptamerului la ligand. Dacă este necesar să se obțină un aptamer care se leagă la o proteină in vivo sau la o celulă întreagă, care este planificată să fie utilizată în scopuri de diagnostic sau terapeutic , atunci se folosesc tampon pentru incubare care sunt aproape de plasma sanguină în concentrații de sare și procesul în sine se desfășoară la temperaturi fiziologice pentru ca aptamerii selectați să se lege cel mai probabil la ligand precis in vivo . Tampoanele de incubație pot conține, de asemenea, concurenți nespecifici. Dacă există o probabilitate mare ca oligonucleotidele care nu se leagă de ligand să rămână totuși în amestecul de reacție datorită legării nespecifice la matriță, atunci concurenții nespecifici (molecule mici sau polimeri similari ca proprietăți cu oligonucleotidele din bibliotecă) vor previne reținerea nespecifică a aptamerilor nepotriviți în amestecul de reacție [11] . Proprietățile aptamerilor selectați pot depinde, de asemenea, de raportul dintre concentrațiile de ligand și oligonucleotide. Dacă cercetătorul nu se confruntă cu sarcina de a obține aptameri cu o afinitate foarte puternică pentru ligand, atunci merită să folosiți un exces de ligand pentru a crește probabilitatea ca cel puțin unele oligonucleotide să se poată lega de acesta. Cu toate acestea, dacă, dimpotrivă, este necesar un aptamer foarte specific care leagă puternic ligandul, atunci oligonucleotidele ar trebui luate în exces. Acest lucru va crea competiție între aptameri și condiții pentru selecția celor mai potriviti dintre ei [2] .
După ce biblioteca de oligonucleotide a fost incubată cu ligand pentru un timp suficient, oligonucleotidele nelegate sunt spălate, în timp ce cele legate rămân legate de ligandul imobilizat [3] . Când secvențele nelegate sunt îndepărtate, este necesar să se elueze aptamerii legați prin ruperea legăturii sale cu ligandul imobilizat. Pentru eluare, sunt create condiții de denaturare în care aptamerii își pierd structura spațială, își pierd legăturile cu ligand și sunt spălați cu apă deionizată [3] . Condițiile de denaturare sunt create de soluții care conțin uree sau EDTA [11] [12] , precum și de temperatură ridicată sau impact fizic. După eluare, oligonucleotidele eliberate sunt supuse transcripției inverse dacă sunt ARN sau dacă trebuie introduse nucleotide modificate [2] [3] [11] , iar nucleotidele ADN sunt pur și simplu asamblate pentru amplificare ulterioară [13] . Fragmentele de ADN obținute sunt amplificate în continuare prin PCR și convertite în ADN monocatenar (ssDNA), ARN sau oligonucleotidă modificată în bază, care va fi folosită pentru următoarea rundă de selecție [2] [3] .
Următorul pas în SELEX este obținerea ssDNA, care va fi folosit pentru amplificarea ulterioară prin PCR. Una dintre cele mai simple moduri de a obține ssDNA este utilizarea primerilor inversi biotinilați pentru PCR, datorită cărora catenele de ADN complementare sintetizate vor transporta biotină. Cu ajutorul biotinei, ele pot fi fixate pe rășină, iar a doua componentă a duplexului poate fi eluată cu o soluție alcalină . O altă metodă de obținere a ssDNA este PCR asimetrică , în care primerul direct este luat în exces, iar primerul invers este luat într-o cantitate foarte mică, datorită căreia sunt sintetizate mai multe fragmente monocatenar. Un dezavantaj al PCR asimetrică este că după PCR, produsul monocatenar trebuie să fie curățat de ADN dublu catenar și alte fragmente străine. Lanțurile inutile pot fi distruse enzimatic , după ce le-au marcat în prealabil astfel încât să fie recunoscute, de exemplu, de exonucleaza lambda . Enzimele vor distruge catena inutilă, iar ssDNA țintă va rămâne intactă [2] [3] .
Pentru a crește specificitatea aptamerilor selectați folosind SELEX, o etapă suplimentară, selecția negativă, poate fi introdusă imediat înainte sau imediat după incubare. Acest pas este necesar pentru a elimina secvențele din amestec care se leagă nu de ligand, ci de matricea pe care este imobilizat [12] [14] [13] . Selecția negativă constă în adăugarea de analogi de liganzi, proteine nespecifice și alte molecule la amestec, care colectează toate oligonucleotidele nespecifice [11] [13] [15] .
Pentru a monitoriza progresul SELEX, se poate compara numărul de molecule de ligand care interacționează cu aptamerii, care este legat de numărul de oligonucleotide eluate, cu numărul total de oligonucleotide eluate teoretic în fiecare etapă. Numărul de oligonucleotide eluate este estimat prin măsurarea absorbanței la o lungime de undă de 260 nm sau folosind oligonucleotide marcate fluorescent . Când procesul SELEX se încheie, proporția de oligonucleotide care se leagă de aptamer ajunge la 100%, iar numărul de oligonucleotide eluate devine egal cu (sau puțin mai mic decât) dimensiunea bibliotecii utilizate în incubație [3] [16 ]. ] .
În prezent, SELEX utilizează nucleotide modificate chimic. Prezența nucleotidelor modificate chimic în oligonucleotide poate oferi avantaje suplimentare potențialilor aptameri, cum ar fi creșterea stabilității și rezistenței lor la nucleaze , îmbunătățirea legării la ținte specifice, modificarea proprietăților fizice (de exemplu, creșterea hidrofobicității ) și creșterea numărului de posibile nucleotide. structuri pentru o anumită oligonucleotidă. Nucleotidele cu baze azotate nenaturale au fost deja folosite în SELEX, iar în unele cazuri, datorită utilizării lor, s-a putut obține aptameri ADN cu afinitate mare pentru țintă [8] [9] [17] .
SELEX a fost conceput pentru a produce, prin evoluție direcționată, aptameri cu afinitate foarte mare pentru liganzi specifici, inclusiv molecule mici precum ATP [18] și adenozina [10] [19] , precum și proteine (de exemplu, prioni [20] și factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) [21] ). SELEX este folosit pentru a genera aptameri de mare afinitate pentru structuri mai complexe, cum ar fi celulele tumorale [22] . Se dezvoltă aptameri care leagă în mod specific markerii tumorali [23] , proteina fluorescentă verde și fluoroforii înrudiți [24] . FDA a aprobat deja un aptamer care leagă VEGF cunoscut sub numele de pegaptanib pentru tratamentul degenerescenței maculare [21] [25] . SELEX a fost folosit pentru a produce ADN catalitic foarte specific (DNA zymes). Sunt cunoscute mai multe ierni ADN specifice metalelor [26] , inclusiv ierni ADN specifice cuprului [27] , uraniului [28] și sodiului [29] . Biosenzori bazați pe aptameri sunt în curs de dezvoltare [30] ; în plus, acestea sunt planificate să fie utilizate pentru marcarea fluorescentă a proteinelor [31] și a celulelor [32] , precum și pentru inhibarea selectivă a enzimelor [33] .