Cromatografia în strat subțire

Cromatografia cu strat subțire este o metodă cromatografică în care un strat subțire de adsorbant este utilizat ca fază staționară . Metoda se bazează pe faptul că substanțele care trebuie separate sunt distribuite diferit între stratul de sorbing și eluantul care curg prin acesta , ca urmare a cărei distanță prin care aceste substanțe sunt deplasate de -a lungul stratului în același timp variază. Cromatografia cu strat subțire oferă oportunități mari pentru analiza și separarea substanțelor, deoarece atât sorbentul, cât și eluantul pot varia pe o gamă largă. Plăcile cu diverse sorbenti sunt disponibile în comerț, ceea ce face posibilă utilizarea metodei rapid și de rutină. O variație a cromatografiei cu strat subțire este mai fiabilă și mai reproductibilă.Cromatografie cu strat subțire de înaltă performanță , care folosește plăci speciale și echipamente sofisticate.

Cromatografia cu strat subțire a fost descoperită în 1889, dezvoltată semnificativ la mijlocul secolului XX și este încă utilizată pe scară largă în domeniile farmaceutice, medicale, alimentare, precum și în științele academice și industriale.

Istorie

Condiția prealabilă pentru crearea metodei a fost utilizarea cromatografiei de hârtie de către Schönbein în 1861 [1] . Această metodă a fost dezvoltată în lucrările lui Goppelsreder, un student al lui Schönbein, în anii 80 din secolul XIX [2] . Tehnica la acea vreme se numea analiză capilară. Lucrarea a fost practic uitată, iar în 1944 cromatografia celuloză a fost redescoperită de Conseden și colab. Metoda de cromatografie cu strat subțire, aproape sub forma în care este cunoscută acum, a fost folosită pentru prima dată de biologul olandez Martin Beijerinck în 1889. În timp ce studia difuzarea acizilor sulfurici și clorhidricali în gelatină , Beyerink a descoperit că acidul clorhidric se mișcă mai repede decât acidul sulfuric. În experimentele sale, el a detectat zona de acid clorhidric, adăugând o soluție de clorură de argint la strat și zona de acid sulfuric prin adăugarea unei soluții de clorură de bariu . În 1898, Wijsman a aplicat o metodă similară cu determinarea enzimelor în diastază de malț și a fost primul care a utilizat detectarea fluorescentă ; Sensibilitatea metodei la acea vreme a făcut posibilă determinarea prezenței unei substanțe în cantitate de 40 pg [3] . În ciuda acestui fapt, atât cromatografia pe coloană, dezvoltată de M. S. Tsvet la începutul secolului XX, cât și cromatografia cu strat subțire nu au fost utilizate de fapt până în anii 1930 [4] .

În 1938, Izmailov și Schreiber au raportat efectuarea cromatografiei circulare pe un strat de oxid de aluminiu depus pe o placă de sticlă. În acest caz, straturile de substanțe separate au luat forma unor cercuri concentrice. Cercetătorii au demonstrat că metoda poate fi utilizată pentru testarea sorbenților și eluenților pentru cromatografie pe coloană [3] .

Progresul semnificativ în dezvoltarea metodei TLC au fost realizate de J. Kirchner și colaboratori, care în 1945-1954 au lucrat la izolarea substanțelor mirositoare din fructele citrice prin metode cromatografice. Convinși de inaplicabilitatea cromatografiei de hârtie în scopurile lor, au dezvoltat o metodă care a combinat avantajele cromatografiei de hârtie și coloană, dar nu a atras multă atenție până când a fost anunțată de Desaga și Merck [3] .

До середины 50-х годов XX века для описания метода использовали термины «хроматография на полосках», «хроматография на пластинках», «хроматография в тонких плёнках», «хроматография в открытой колонке», однако термин «тонкослойная хроматография», который был предложен Э . Шталея 1956 году [5] оказался настолько удачныы, что ыыыеснил все остальные.

Faza staționară

Пластинки н нанесённыы адсорбционныы слоеpare появили până На подложку, обычно иззотовленcosю ianuarie с стекла , пластика или алююиния , наносят сорбеннты р раззер dispoziția Толщина слоя составляет от 100—250 мкм (для аналитических пластинок) до 2 м д (для препаратив exempa Стандартный формат пластинок - 20 × 20 с с, но существvorют также форматы 10 × 20, 5 × 20 и 2,5 × 5 с. Пластинкcați необходиckоого раззера можно ырезать самостоятельно. Ыы sprijiți также пластинки каналаяmisional, облеcun чающими нанесение образцов и препятств deose mai Такие слои служат для очистки образца, а также для формирования зкой полосы пере problema

Пластинки для ыыокопроизводительной т т ыыли предложены в тщщ 10 × 20 × × 10 × 10 × 10 × × 10 × 10 × × × 10 × × × 10 × × 10 × ×. Такие пластинки обладают повышенной разрешающей способmpăile рззающающей способmpăile р , э эээенени пооэser. В 1995 году появилиctive у уечшенные ыыоко „р з cord дительные пластинкицами. В 2001 году на рыые ыыли предложены пластинки с монолитныы слоея, которые нашли применение лиш в [6] .

В качестве адсорбентов исторически применялись несколько материалов: оксид алюминия (кислый, нейтральный и основный), кизельгур (очищенная диатомитовая земля), полиамиды, катионообменные смолы. Эти материалы и сегодня упоминаются в учебниках и научных статьях, однако они утратили своё значение, и их производство, в основном, остановлено[6].

Для œпрочнения пластин может исполззоваться связывающеее вещество. Ранее для этих целей, наiserrisoр, властинках с с с cordal с ззовале su, широко ianvi В соврея и имеющихся продаже пластинках исполззиющие оеще cord ческие свар веществаuter ы). В литератprezeре описано также приmisенение крахх sep

Чтобы сделать определение положений зон веществ более Éдобныы в вдсорбитdelраарcom. При облcursчении такого слоя утрафиолетовыы излучением с длиной волны 254 нм осаёаёз зелёоое и и далёё зелёоое и и и даеiser зелоое (F 254 ) и и балеmant зелёое (F 254 ). При этом зона вещества, поялощающего Üьтрафиолет, ыыцир deose н на фоне флizie й [6] .

Silicagel

Силикагель получают путёё осаждения кислотой из растворов силикатов или гидролизом производных кре§ . Диа§veniтр получаемых частиц зависит от àсловий, наniuиеер, изменение и п х cord. С точкtări зрения химии, поверхность силикагеля содержит силоксановые ( si-o-si) ian Силанольные грú „могprezeт ыыть сободныыиыи, вицинальныыи ianuată ian Они также могут заимодействовать друnțe с друго§ за чёчё образования водоророtament с с ззей [6] .

Таким образом, силикаель харак… Тработаны менее, разработаны методы, позволяющие получать силикааель сфферической форы arззаданы р раззероры. Многие марки ianvate

Силикагель имеет весьма высокое сродство к воде и быстро устанавливает с ней равновесие, поэтому результат, получаемый при проведении ТСХ, может в некоторой мере зависеть от влажности в помещении[6].

Оксид алюtăriиния является полярныы неорганическим гидрофильныы сорбенто§. Его получаюю, термически удаляя воду из гидратированно§ гироксида алююиния . Оксид алюtăriиния для хроматоярафии обычно наяревают до невысокой температуры, нол ope. Сорбированая вода UL уаляется пoри тем "

Faze staționare modificate

Силикагель может быть модифицирован тремя типами реакций: этерификацией, взаимодействием с хлорсиланом, содержащим необходимый органический заместитель, или хлорированием с последующей обработкой литийорганическим соединением. Такая модификация приводит к образованию неподвижных фаз с особенными свойствами, которые зависят от природы заместителей и способа их присоединения к силикагелю[6].

Полноценные обращённые фазы содержат цепи с8 или с18. В нормально -фазово deja режиме они обладаюю меншшей удерживающей сособностюю и нч ющей и rezervă 

Celuloză

Первой формой исполззования целзылозы в тонкослойной хроматорафии ыыла бамажжая хроматорафи .

Обозначения взазваниях имеющихся продаже пластинок для тсх [8]
Reducere Sens
Chir Хи 3 _
CN Гиportați _
Diol Гиportați _ _
F Содержит флуоресцентный индикатор
F 254+366 Lungimi de undă de excitație a indicatorului fluorescent
F 254S Indicator fluorescent rezistent la acid
G Gips
H Не содержит модификаций
NH2 _ Strat hidrofil cu grupuri amino
P Для пoреctor рараuter cord
R Специально очищенный
RP Обращёщёая фаза
RP-8, RP-18 Fază inversă cu pornire de 8 sau 18 carbon
Silanizat, RP-2 Fază inversată cu modificare a dimetilsililului
W Strat udat
40, 60, ... Dimensiunea medie a porilor în angstroms

Faza mobilă

Подвижная фаза отвечает за переprezeщение образца по хромато extremчической систея важалалалала istru Вчачестве подвижной фазы т т позволяет исп dispoziția При проведении хроя; В обращённо -фазовой хромато extremфии применяюю смесь воды с орnțeн Na Миниokаальныы требованием к подвижной фазе ялncomyется по ррайней мере частичная растоазцамость.

Puterea solventului

Сила растворителя - это пара dejaетр, оределяющий сосоstit cord тщать ижной ag Подходящий элюент сдвигает вещество приmisерно на 1/3 о обоего расстояния, преодолёоо расстояния, преодолёоо расстояния, преодолёоо расстояния, преодолёоо расстояния, преодолёоо расстояния, преодолёоо расстояния, преод dispoziția

Для обращённых фаз ситуация противоположная.

Подходящий элюент оsterределяюю экспери dejaентально. Наприnalр, образец может ыыть отхромато extremфирован втилацетате .

Пара dejaетр силы растворителя e ° для различных растворителей на оксиде алю încât
Solvent E ° , al 2 o 3 Solvent E ° , al 2 o 3 Solvent E ° , al 2 o 3 Solvent E ° , al 2 o 3 Solvent E ° , al 2 o 3
Fluoroalcani -0,25 Бутилхлорид 0,26 sulfură de dietil 0,38 acetat etilic 0,58 etanol 0,88
н -пентан 0,00 xilen 0,26 Cloroform 0,40 Метилацетат 0,60 metanol 0,95
Hexan 0,00 Eter diizopropil 0,28 Diclorometan 0,42 Alcool amilic 0,61 etilen glicol 1.11
Isooctan 0,01 2-cloropropan 0,29 МетилизобутилlXXXXоо 0,43 Dimetil sulfoxid 0,62 Acid acetic mare
Ciclohexan 0,04 Toluen 0,29 Tetrahidrofuran 0,45 Anilină 0,62 Apă mare
Ciclopentan 0,05 1-хлорrigпоан 0,30 Dicloroetan 0,49 dietilamina 0,63 Соли и бizieферы foarte mare
Диизобутилен 0,06 Clorobenzen 0,30 Metil etil cetonă 0,51 Nitrometan 0,64
Penten-1 0,08 Benzen 0,32 1-nitropropan 0,53 Acetonitril 0,65
Disulfură de carbon 0,15 Bromoetan 0,37 Acetonă 0,56 piridină 0,71
Tetraclorură de carbon 0,18 dietil eter 0,38 dioxan 0,56 Пропиловые сирты 0,82

Calitatea solventului

В тонкослойной хромато extremфи сещественнmen роль может и§рать качество ianvate. Некоторые растворители при хранении подвер sufletesc Растворители при хранении в металлических ёёкост Ex până la могут разлаrifаться или всту рать в и и иые реакцц.

Efectuarea unui experiment

Pregătirea eșantionului

Для правильного приizeотовления образца необходиpare ыыратьию мрезентаuter ы пырарцию материалалаuter. Обычно для этого необходи§ полностюю растворить еware в подходящем растворителе. Иноjitmis растворить весь образец не удаётся: втом случае необходиckо your уедитисяяяяоааераnal раств.. Этот ша§ реализуется при исполззовании пластинок с преадсорбционныыы слоеpare, который задерживаеты порior кадерживает полalizt

По сравнению с колоночной, тонкослойная хроматография менее требовательна к примесям, поскольку колонки необходимо отмывать перед нанесением новых образцов, а пластинки для ТСХ используются только один раз[11].

Pregătirea înregistrărilor

Иногда перед постановкой тх пластинки подвергают дополнительныы этаiser подготовки [12] .

Aplicarea eșantionului

Нанесение образца на пластинкcați сественно влияет на качество получаемого реззззатаapte. При проведении количественного анализа необходи§ наносить точно иззеренные оъёъёveni растворо „

Существvorbări два сособа нанесения образца: ручной и а т..T Число точек должно ыыть равно числу анализирbookыхых оразцов.

Авто dejaтические и полуавто dejaversă Растворитель удаляется путёё обдувания жатыы воздухом или азото deja. Технология позволяет создавать узкие зоны веществ, что спосоrme dispoziția В последнея случае техника позволяет создать оноророднvorю ытянутую зону вдоль всей пластинки [11] .

После нанесения раствора исследуея с смеси веществ пластинка помещается в сосуд, котщается в сосуд, котщается в сосуд, котщается в сосуд, коороро§м нента. При поalizружении нижнеëо края пластины видкость элюент под действинае … кааюмлраафафаstru cord Чтобы збежать испарения летучего элюента с поверхности пластинки в 16 пиния. После того, как линия фронта достигнет достаточной для анализа ысоты, пластин oc % Расстояние, проходия л линией фронта, принято отсчитывать о линии старта. Его ыыирают достаточныы для последующей идентификации разделёнtt

При проведении хро sute

Существvorюю различные сособы элюирования образцов на пластинках. Наиболее расsterространён сособ с вертикальной пластинкой и подниckющающимсяээюыаааuterзаатаuterйааuterй. Существvorюю также сосуды, позволяющие наsterрравляven подвижную фазз горизонart

Мнояократное элюирование при§меняется, когда онократное не позволяет ээээфеквво розволяет ээээфеективно пделить коээфоек… При повторно/ элюировании в оннцццщser ритирирей же систеязация пщщане .щщser ри2 пана .щщщщщщщщщщщщщщщщ. Предварительное элюирование в неполярном растворителе позволяет удалить неполярнmen матрица из оъъекта [13] .

Двcursionaрное элюирование содержит два последовательных элюирования в перiserх.

Vizualizare

После элюирования разделяемые вещества смеси озыазываются расположенныыи на оераности пXаст Miar в. Для оsterпеделения их положений на пластинке предложен ря comple Однако болшинство орnțeнических соединений бесцветны.

Широко приmiseнютс. Селективные реаëенты, наприnalр, нинnțeирин , позволяюю визprezeализировать соединения конкретноя кола dispoziția к 14 ] .

Хроматографические тонкослойные пластинки также могут быть использованы в биологических тестах для выявления веществ с биологической активностью к микроорганизмам методом посева культур микроорганизмов в питательной среде на пластины[14].

Evaluarea rezultatelor

Вещества могprezealiz также ыыть сыты с хромато extremфическоого слоя для дальнейшйшодо налinar. Сканирующая денситоckетрия даёт информацию о сектральных сойствах веществ на с с este в т веществ. Для повышения точности анализа применяется сравнение с пектров ззааже мmen б данно а. Количественная цценка также проводится при помощи сканирующеëо денсито dejaетра [15] .

Teoria cromatografiei cu strat subțire

Flux de solvent

Поток подвижной фазы через слой в тонкослойной хроматорафии ызызван действием капиллportaых дил. Движение фронта жидкости можно описать квадратичной зависимостю ю:

где z f  - расстояние о линии  по .. S инженером анри дарси , который исследовал скорость проникновения почвенных вод через пористую поверхность. Равнение показывает, что скорость миграции фронта гиперболически ™ уывает с у уеличение.. Так, напри deja, при заданно deja значении ϰ = 3,3 см²/с миграция фронта на 10 с заниямает 30 м cal н , Постоянная потока ϰ опstern пределяется диа§0 частиц сорchimента, т также отношениемс э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э dvs. Сорбированая на слое вода часто связывается со слоеpare болеее сильно, чем комоненты элюента. В таком случае попавшая в слой вода снижает пористость слоя и у уеличивает скорость căsătorit. Если сила элюента и воды сопоставиcko, то элюент ыыыесняет воду из слоя [18] .

Sorption izoterm

Udюбой хромато extremфический процесс основан на перерасsterреелении вещества междpreze este подвижа§. Это равновесие связано с температprezeрой, причёчё при её повышении доля вещества военижиной фещества воениж explica веще ычычыч вееac/ Для численного описания равновесия водятся коээициенты перасsterрределения:

где с S и с M - концентрации вещества в сорбирующей и несорбирующей  фазах, сответственно. Коээцициент перерасsterрределения определяет уamenол наклона изотерыы сорбци лрееееееуууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууу cutDo .  Зstru . Для вогнmenй изотерpare сорбции (где k снижается при увеличении концентрации вещества) у хсс. При ыыеклой изотерpare сорбции наблюдается противоположная сtări ция: разззвается передня часть пoare [19] . В сложных сесях комriuоненты могут вллnalят друnțe на друnțe и создавать œловия заиuterмйавать œловия заиuterй п перегрузки. В® с слnчае к с сижается [19] . Спряportaască ianuarie ianuarie зотерм может ыы акивации сорбеннiser (нриририри при дорzon пonă. Сорбционнные центры заниямаются дезактир utiliz

Poziția zonelor de pe farfurie

Обычныы и самыы простыы пара dejaетром, оиисывающим положение зоны вещеgan

где z x  - расстояние, пойденное зоной, а z f  - z 0  - расстояние о л л лас dispoziția старта до фронта ра dispoziție Этот пара dejaетр леëко иззеряется, однако он не содержит информации не с лловиях хрорматцации о œловиях хрояматоярафическоого пoроццатоя ричческоого п хроцаатоафичческоо§ пoр dispoziția

Как правило, расстояние, пройденное веществом, измеряют от точки старта до середины зонесвом. Такой метод подходит для зон небольшого размера, однако в анализах чистоты фармацевтических препаратов, где загрузка вещества достигает 1000 мкг на точку, пятна часто уширяются настолько, что значение hR f колеблется в области 18 единиц. К тому же, если рядом с такой точкой элюировать образец с гораздо более низкой концентрацией, то центр получившейся точки небольшого размера вряд ли точно совпадёт с центром уширенной зоны. Поэтому значение hR f иногда дают в виде интервала, охватывающего значения от низачения от нижасней дчосней 2 чатому Принципиально иным параметром является значение R st , вычисляемое как частное от деления пути, пройденного веществом, на путь, пройденный некоторым эталонным веществом. В настоящее время этот параметр практически утратил своё значение [21] .

Чтобы чётко описать степень разделения двух веществ, в тонкослойной хроматографии вводится параметр разрешающей способности R s , определяемой как частное от деления расстояния между центрами двух пятен z x2  — z x1 на ширину хроматографического пика:

Из уравнения видно, что чем выше расстояние между центрами пятен, тем разделение лучше, а чем шире пятна (соответственно, больше параметр σ — среднеквадратическое отклонение), тем вещества разделены хуже. При Rs = 0,5 расстояние между пятнами составляет σ1 + σ2 ≈ 2σ, то есть в данном случае происходит «разделение на 2σ» и перекрывается 20 % площади двух зон. При разделении на 4σ перекрывается лишь 3 % площади[22].

Aplicație

Выделяют три основных области применения тонкослойной хроматографии [23] .

  1. Демонстрация основ хроматографии, быстрые предварительные эксперименты для оптимизацад. предварительные эксперименты для оптимизацад.
  2. Исследовательские инструменты в академической и прикладной промышленной науке, исполенты в академической и прикладной промышленной науке; комбинация планарного разделения с биологической, спектроскопической и масс-спектрометрической детекцией (замена методу колоночной хроматографии).
  3. Идентификация медицинских и пищевых растительных компонентов по валидированным методикам с повышенными требованиями к точности, воспроизводимости и чувствительности.

Note

  1. ↑ Schoenbein CF Verhl. Naturforsh. Ges. Basel, 3, 249 (1861)
  2. cincisprezece.
  3. 17-20.
  4. douăzeci.
  5. unu.
  6. 2—5.
  7. ↑ Гейсс, том 1, 1988 , с. 375—377.
  8. 19.
  9. ↑ См. раздел Элюирование
  10. ↑ 1 2 3 4 5 Ullmann, 2012 , p. 5-7.
  11. 7-9.
  12. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , p. 41-49.
  13. ↑ 1 2 3 4 Ullmann, 2012 , p. 9-12.
  14. 12-14.
  15. 14-16.
  16. ↑ Geiss, volumul 1, 1988 , p. 39-42.
  17. ↑ Geiss, volumul 1, 1988 , p. 45-52.
  18. 61.
  19. ↑ 1 2 3 Гейсс, том 1, 1988 , с. 146—151.
  20. ↑ Geiss, volumul 1, 1988 , p. 152-153.
  21. ↑ 1 2 3 Hahn-Deinstrop, 2007 , p. 4-6.
  22. ↑ Geiss, volumul 1, 1988 , p. 203-205.
  23. 2.

Literatură

Cărți

Recenzii