Secvențierea ADN-ului cu o singură celulă

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită pe 12 octombrie 2019; verificările necesită 5 modificări .

Secvențierea ADN-ului unicelular este o  abordare care permite obținerea de date despre secvența ADN a unei celule individuale folosind secvențierea și, prin urmare, identificarea diferențelor între celulele individuale ale organismelor unicelulare , organele, țesuturile și subpopulațiile de celule ale organismelor multicelulare . Abordarea face posibilă analizarea caracteristicilor funcționale ale celulei în contextul micromediului. Secvențierea genomului cu o singură celulă implică mai multe etape: izolarea unei singure celule, amplificarea întregului genom , generarea bibliotecii și secvențierea ADN-ului folosindmetode de secvențiere de nouă generație .

Odată cu apariția unei varietăți de metode de secvențiere, a devenit posibilă stabilirea secvenței ADN-ului genomic . Cu toate acestea, cele mai multe date până în prezent au fost obținute prin secvențierea probelor de ADN genomic izolate din populații de microorganisme sau subpopulații celulare ale organismelor multicelulare [1] . Cu toate acestea, se știe că diversitatea în cadrul ambelor grupuri poate fi semnificativă, deoarece celulele înseși au contribuții diferite la existența unei populații sau a unui organism.

Secvențierea genomului unei singure celule face posibilă transferul studiului genomului la nivel celular. Astăzi, ajută la rezolvarea unor probleme precum secvențierea de novo a microorganismelor necultivabile [2] , studierea mozaicismului genetic în cazuri normale și patologice [3] , identificarea și studierea contribuției subpopulațiilor de celule tumorale la dezvoltarea cancerului și apariția rezistenței la tratament [4] .

Provocări tehnologice

Secvențierea ADN-ului cu o singură celulă se confruntă cu provocările izolării fizice a celulelor individuale , alegerea unei metode de amplificare cu cel mai mic potențial de introducere a erorilor pentru a obține o cantitate suficientă de material și alegerea unei metode de secvențiere [5] [6] .

Izolarea celulelor individuale

Primul pas în izolarea celulelor este crearea unei suspensii de celule viabile care nu sunt conectate între ele. Scopul izolării poate fi fie o selecție aleatorie a celulelor pentru a crea un eșantion reprezentativ atunci când se analizează compoziția subpopulațiilor, fie o căutare țintită pentru anumite celule. În studiul țesuturilor dure, este necesară disocierea mecanică sau chimică preliminară a probei, iar condițiile de disociere ar trebui să acționeze în mod egal asupra tuturor subpopulațiilor de celule tisulare. Acest lucru este necesar pentru a crea un eșantion care este imparțial în raport cu setul original de celule , unde este păstrată reprezentarea inițială a celulelor, ceea ce poate fi important pentru analiza compoziției subpopulațiilor. Trebuie avut în vedere faptul că condițiile de disociere a țesuturilor normale și nesănătoase pot diferi, așa că în această etapă este important să alegeți condițiile adecvate. Lucrul cu probe întregi de țesut este de asemenea posibil, de exemplu, folosind microdisecția cu captură cu laser [7] .

După obținerea suspensiei, celulele pot fi izolate prin diluare în serie [8] , micropipetare [9] , diluare cu microgodeuri [10] , folosind pensete optice . Citometria în flux fluorescentă poate fi utilizată pentru a izola celulele cu proprietăți fluorescente specifice, care pot fi fie naturale, fie introduse de experimentator. Metodele automate de micromanipulare [11] [12] au primit recent o mare dezvoltare , inclusiv izolarea celulelor pe cipuri folosind tehnologii microfluidice [13] ; luarea de nanobiopsii face deja posibilă studierea ADN-ului organelelor individuale [14] . Celulele izolate sunt supuse ulterior lizei .

Amplificarea întregului genom

Următorul pas, amplificarea întregului  genom (WGA ), este folosit pentru a genera suficient ADN pentru a detecta semnalul și a-l extrage din zgomot în viitor în timpul secvențierii. În același timp, este de dorit să se minimizeze introducerea unor astfel de artefacte cum ar fi amplificarea preferențială a secvențelor simple, introducerea de mutații aleatoare și formarea de secvențe himerice. Recent, a apărut un set de posibilități de rezolvare a acestei probleme. Utilizarea PCR nu s-a justificat, de exemplu, datorită frecvenței crescute de introducere a erorilor de către polimerazele termostabile . Prin urmare, metode izoterme și hibride, cum ar fi metoda de amplificare cu amplificare cu deplasare multiplă ( English  Multiple displacement amplification, MDA ) și amplificare cu rectificare și buclă multiplă ( English  Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC ) [15] .

MDA

MDA permite amplificarea rapidă a ADN-ului fără a fi nevoie de PCR. Metoda se bazează pe utilizarea polimerazei fagice phi29, care se caracterizează printr-o procesivitate crescută ( poate sintetiza regiuni cu lungimea de peste 10 kilobaze fără disociere) și o rată de eroare scăzută (1 la 10 6-10 7 perechi de baze ). Reacția se desfășoară după cum urmează: primerii hexamerici sunt recoapți pe matrice, alungiți de polimerază; când enzima întâlnește un alt primer (care se alungește și el), îl înlocuiește (înlocuiește) și își continuă drumul prin șablon. Locul substituit nou sintetizat servește ca un loc de aterizare pentru noii primeri și devine un șablon. Astfel, se formează un arbore ramificat, unde pe fiecare ramură are loc sinteza. La sfârșitul procedurii, polimeraza este inhibată , nucleaza S1 este adăugată pentru a scinda ramurile la situsurile de ramificare și ADN polimeraza I pentru a completa secțiunile monocatenar rezultate [15] .

Metoda are o serie de probleme cum ar fi pierderea alelelor , amplificarea preferenţială şi interacţiunile dintre primeri. Prima problemă apare din amplificarea aleatorie a doar una dintre alele la heterozigoți , rezultând în heterozigoți identificați incorect ca homozigoți . Datorită frecvenței mari a acestui efect (0 - 60%), acuratețea genotipării scade . A doua problemă este supraamplificarea unei alele față de altele. Interacțiunile dintre primerii hexameri apar datorită naturii aleatorii a secvențelor; pot fi reduse semnificativ prin introducerea de restricții asupra sintezei acestor primeri [15] .

MALBACS

MALBAC este o metodă hibridă liniară de amplificare a întregului genom. Metoda se bazează pe primeri speciali: au 35 de nucleotide lungime , dintre care 27 sunt la fel în toți primerii (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), iar restul de 8 nucleotide variază. Întregul proces de amplificare este descris după cum urmează [9] :

  1. Topirea (94 °C) a ADN-ului dublu catenar cu formarea de fragmente monocatenar.
  2. Răcire (0 °C), adăugare de primeri și polimerază.
  3. Recoacerea primerilor în locații aleatorii pe șablon. ADN polimeraza Bst alungește primerii pentru a forma un semiamplicon la 64°C. Toți contragrundurile sunt îndepărtate de șablon.
  4. Topire (94 °C), separarea semiampliconului de matrice.
  5. Răcire (0 °C), adăugare de primeri și polimerază. Primerii se leagă eficient atât de șablon, cât și de semiamplicon.
  6. ADN polimeraza Bst extinde primerii la 64°C. Se sintetizează semiampliconii pe matricea inițială, ampliconii completi se sintetizează pe semiampliconii obținuți mai devreme .
  7. Topire (94 °C).
  8. Bucle (58°C): Capetele 3’ și 5’ ale ampliconilor completi sunt complementare între ele și formează o buclă, împiedicând utilizarea ampliconului complet ca șablon.
  9. Repetați pașii 5-8 de cinci ori.
  10. PCR folosind 27 de nucleotide comune ca primeri pentru a amplifica numai ampliconii completi [9] .

Avantajul metodei este reducerea zgomotului asociat cu natura exponențială a amplificării PCR datorită introducerii amplificării cvasiliniare preliminare. Acest lucru a făcut posibilă creșterea acoperirii genomului (proporția din genom acoperită de cel puțin o citire), pentru a reduce probabilitatea pierderii alelelor și a polimorfismelor cu un singur nucleotide (SNP). În plus, pentru intrare este necesară o cantitate foarte mică de ADN inițial, cu toate acestea, orice contaminare a probelor poate afecta semnificativ rezultatele secvențierii [9] .

Dezavantajul este că, pentru a scăpa de rezultatele fals-pozitive, este necesar să se compare rezultatele secvențierii a 2-3 celule atât din aceleași linii celulare, cât și din linii diferite [9] . În acest caz, unele polimorfisme pot fi pierdute, deoarece celulele aparținând aceleiași linii celulare au încă unele diferențe în genom. În plus, ADN-polimeraza bst utilizată are o rată de eroare ridicată (1 din 10 5 baze) [16] .

Comparația metodelor de amplificare a întregului genom

Recent, au existat mai multe studii care compară aceste metode [17] [18] [19] . Un studiu a concluzionat că MDA oferă o acoperire mai mare decât MALBAC (84% și, respectiv, 52%), ceea ce permite detectarea mai precisă a polimorfismelor cu un singur nucleotide [17] . Totuși, MALBAC oferă o acoperire mai uniformă și, prin urmare, permite detectarea mai precisă a variațiilor numărului de copii (CNV) [17] . Interesant, la secvențierea unor celule, nivelul de detectare a variațiilor numărului de copii prin metoda MDA a fost comparabil cu cel al MALBAC [17] . Alți autori confirmă, de asemenea, diferența de acoperire între MDA și MALBAC (84% și 72%) și uniformitatea comparativ mai mare a acoperirii MALBAC ( coeficient de variație 0,10 versus 0,21 pentru MDA) [18] . S-a demonstrat că MDA produce mai puține false pozitive, dar numărul de fals negative variază de la experiment la experiment [18] . MALBAC oferă o rată mai mică de pierdere a alelelor (21%), cu toate acestea, acoperirea sa este mai mică decât cea a MDA [18] . În general, nu este clar care dintre ele duce la mai puține fals negative, deoarece MDA acoperă mai mult din genom, dar pierde mai multe alele din cauza amplificării preferențiale doar a uneia dintre alele la heterozigot [15] [18] .

Astfel, MDA și MALBAC au un set de avantaje și dezavantaje, iar alegerea ar trebui să depindă de sarcina la îndemână.

Crearea unei biblioteci

După amplificare, bibliotecile pot fi preparate folosind truse comerciale. Mai multe opțiuni sunt posibile aici: alegerea unui locus specific , alegerea unui exom sau a întregului genom pentru secvențierea ulterioară. Fiecare dintre aceste opțiuni presupune anumite valori de acoperire, tendință de eroare și cost [20] . Selectarea zonelor mici vă permite să vă concentrați asupra zonelor care aduc cea mai mare contribuție biologică la activitatea sistemului studiat. Acest lucru reduce costul cercetării și probabilitatea de a introduce erori în pregătirea probelor. Utilizarea genomului de referință reduce rezultatele fals pozitive, deși limitează polimorfismele de un singur nucleotide detectate la cele prezente în genomul de referință. Secvențierea exomului face posibilă izolarea caracteristicilor unice ale celulelor, cu toate acestea, odată cu creșterea lungimii regiunii secvențiate, probabilitatea de a introduce erori în timpul amplificării crește. Utilizarea întregului genom face posibilă identificarea regiunilor necodante și structurale, dar costul cercetării crește dramatic, ceea ce face dificilă efectuarea secvențierii întregului genom a multor celule [20] .

ADN-ul din biblioteci create într-un fel sau altul este folosit în secvențiere prin una dintre metodele existente .

Prelucrarea datelor

Greșeli comune

Cele mai multe artefacte de secvențiere apar în timpul pregătirii probei: izolarea celulelor, contaminarea ADN-ului genomic, amplificarea și generarea bibliotecii, deoarece toți acești pași introduc erori suplimentare, pierderea acoperirii, reducerea omogenității acoperirii, prejudecățile de eșantionare în selecția preferențială a anumitor grupuri de celule și amplificare. a anumitor secvenţe de ADN sunt cauza pierderii alelelor în poziţiile heterozigote. De asemenea, trebuie luate în considerare liniile celulare, pe care se realizează optimizarea tuturor etapelor de secvențiere: nu toate celulele sunt diploide , există atât populații haploide , cât și aneuploide , iar ploidia lor poate afecta semnificativ experimentul [4] . Un obstacol în calea comparării rezultatelor diferite în acest domeniu este uneori lipsa de informații cu privire la numărul total de celule evaluate și măsura evaluării calității secvențierii în studii specifice [20] .

Polimorfisme cu un singur nucleotide

Polimorfismele cu un singur nucleotide, conform proiectului 1000 de genomi , aduc cea mai mare diversitate genomului uman [21] : 38 de milioane de polimorfisme cu un singur nucleotide, 1,4 milioane de inserții / ștergeri și peste 14 mii de deleții mari [21] au fost confirmate pe harta haplotipului . De asemenea, se presupune că multe boli complexe, precum boala Alzheimer [22] , diferite tipuri de cancer [23] , boli autoimune [24] pot fi asociate tocmai cu prezența polimorfismelor.

Astăzi, căutarea polimorfismelor în datele de secvențiere cu o singură celulă se bazează pe aceiași algoritmi ca și analiza rezultatelor secvențierii convenționale: GATK [25] , SNPdetector [26] , SOAPsnp [27] , VarScan [28] . Cu toate acestea, există diferențe între secvențierea populației celulare și secvențierea unei singure celule: aceasta din urmă are o acoperire mai mică a genomului și o rată mai mare de fals pozitive.

Variația numărului de copii ale segmentelor ADN

Variațiile numărului de copii ale fragmentelor de ADN conduc la un număr anormal de copii ale acestor fragmente; diversitatea acestui tip de polimorfism genetic afectează și sănătatea umană [29] [30] . Unele studii subliniază legătura lor cu dezvoltarea tumorilor [31] , a bolilor autoimune [24] , autismului [32] , etc. Aici, ca și în căutarea polimorfismelor cu un singur nucleotide, se folosesc practic aceiași algoritmi ca și pentru secvențierea convențională: CNV -seq [33] , PenCNV [34] , CNAseg [35] , ReadDepth [36] și cn.MOPS [37] . Pentru a ține cont de zgomotul introdus este necesar să se analizeze efectul metodelor de amplificare asupra apariției și dispariției variațiilor numărului de copii ale ADN [38] .

Analiza comparativă a celulelor

O strategie pentru gruparea celulelor bazată pe date genomice este introducerea unei funcții de distanță care cuantifică diferențele dintre perechile de probe [39] . În acest caz, Măsura Jaccard este considerată cea mai potrivită datorită naturii binare a datelor genetice (vezi mai jos) [40] . O alternativă la metodele bazate pe funcții de distanță este gruparea bazată pe model , care presupune o abordare probabilistică: în loc de distanțe „dure”, sunt introduse probabilități „soft” de origine a celulelor din diferite clone.

După ce am prezentat datele secvențierii unei singure celule ca o matrice , unde mutațiile de interes sunt marcate vertical, iar celulele sunt marcate orizontal, le umplem cu 0 și 1, în funcție de prezența unei anumite mutații într-o anumită celulă. Dacă se examinează o tumoare, atunci în timp se caracterizează prin extinderea unor clone și dispariția altora [41] . În același timp, nu știm câte dintre care clone sunt prezente și presupunem că o parte din date s-a pierdut în timpul pregătirii probei.

Parametrii modelului, cum ar fi probabilitatea ca o celulă să coboare dintr-o anumită clonă, precum și rata fals negativă, pot fi estimați folosind un algoritm de maximizare a așteptărilor [42] . Apoi problema determinării numărului de clone se reduce la alegerea unui model statistic care descrie cel mai bine datele de secvențiere; evaluarea se realizează folosind criteriile de informare ale lui Bayes și Akaike [43] . Există, de asemenea, o abordare hibridă care permite gruparea inițială folosind o funcție de distanță, care crește viteza de clustering bazat pe model, ceea ce necesită o putere mare de calcul [44] . Pe baza rezultatelor grupării, se construiește un profil al mutațiilor clonale consensuale [45] . Potrivit acestuia, folosind diferite metode de construire a copacilor , este posibil să se identifice relația dintre diferite clone. De exemplu, este posibil să se demonstreze istoricul evolutiv al unei tumori [45] .

Realizări

Evoluția clonală a celulelor canceroase de sân

Analiza modelelor de mutații (inserții, deleții, substituții de un singur nucleotide, variații ale numărului de copii ale genelor ) ale diferitelor populații de celule canceroase de sân a făcut posibilă identificarea atât a unui set de mutații caracteristice fiecărei populații (mutații clonale), cât și a celor care au apărut în mai multe celule (mutații subclonale) . Datele au fost obținute folosind secvențierea exomului cu o singură celulă, verificată prin secvențiere profundă. Studiul a folosit celule ale populațiilor aneuploide ale ERBC (ER + /PR + /Her2 - ) și TNBC (ER - /PR - /Her2 - ), care diferă prin prezența anumitor receptori (ER/PR/Her2) pe membrană. suprafață, precum și celulele diploide normale. Rezultatul a fost identificarea a mult mai multe mutații clonale în populația TNBC în comparație cu ERBC și celulele normale. În populația de celule TNBC, a fost demonstrată existența a trei subpopulații de celule canceroase, identificate prin modele de mutații subclonale. S-a obținut dovezi că TNBC are o rată de mutație mai mare, iar acumularea lor poate apărea nu numai din cauza erorilor în timpul proliferării accelerate [4] .

Nu este încă clar cum exact tumorile devin rezistente la chimioterapie . Fie că există deja celule rezistente rare în populație, fie răspunsul apare spontan după acțiunea medicamentelor. În plus, nu este întotdeauna clar de ce se acumulează mutațiile: fie este vorba de o rată accelerată de mutație, ca în cazul TNBC, fie este vorba de acumularea de mutații într-un ritm normal, dar în număr mare datorită proliferării accelerate [4] .

Perspective

În prezent, principala problemă este prezența unui pas de amplificare a ADN-ului genomic responsabil de introducerea celui mai mare număr de artefacte. Cerințele pentru cantitatea de ADN în pregătirea bibliotecilor sunt din ce în ce mai în scădere, iar crearea directă de biblioteci din ADN izolat a fost deja demonstrată [46] [47] . Mai mult, s-a demonstrat că este posibil să se renunțe complet la biblioteci prin transmiterea ADN-ului izolat dintr-o celulă pentru secvențiere [48] . Există, de asemenea, posibilitatea dezvăluirii informațiilor epigenetice , cum ar fi căutarea modelelor de metilare [49] [50] și captarea stării conformaționale a cromozomilor [51] . Astăzi, oamenii de știință operează în mod obișnuit pe zeci până la sute de celule, dar dezvoltarea de platforme automate pentru captarea celulelor, amplificarea ADN-ului și pregătirea bibliotecii va crește semnificativ scara și disponibilitatea analizei unei singure celule, permițând efectuarea de experimente mai mari într-un timp mai scurt. [52] .

Utilizarea secvențierii ADN-ului cu o singură celulă, împreună cu studiile epigenomice și transcriptom, va face posibilă clasificarea cu precizie a celulelor și completarea perspectivei existente asupra populațiilor de celule. De asemenea, va deveni posibil să se stabilească relații între secvența genomului, starea epigenetică și expresia genei și să se determine funcționalitatea celulelor [52] .

Vezi și

Note

  1. ↑ Tringe SG , von Mering C. , Kobayashi A. , Salamov AA , Chen K. , Chang HW , Podar M. , Short JM , Mathur EJ , Detter JC , Bork P. , Hugenholtz P. , Rubin EM Comparative metagenomics of microbial comunitățile.  (engleză)  // Știință (New York, NY). - 2005. - Vol. 308, nr. 5721 . - P. 554-557. - doi : 10.1126/science.1107851 . — PMID 15845853 .
  2. ↑ Marcy Y. , Ouverney C. , Bik EM , Lösekann T. , Ivanova N. , Martin HG , Szeto E. , Platt D. , Hugenholtz P. , Relman DA , Quake SR Disecarea „materiei întunecate” biologice cu o singură celulă analiza genetică a microbilor TM7 rari și necultivați din gura umană.  (engleză)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - Vol. 104, nr. 29 . - P. 11889-11894. - doi : 10.1073/pnas.0704662104 . — PMID 17620602 .
  3. ^ McConnell MJ , Lindberg MR , Brennand KJ , Piper JC , Voet T. , Cowing-Zitron C. , Shumilina S. , Lasken RS , Vermeesch JR , Hall IM , Gage FH Mozaic variația numărului de copii în neuronii umani.  (engleză)  // Știință (New York, NY). - 2013. - Vol. 342, nr. 6158 . - P. 632-637. - doi : 10.1126/science.1243472 . — PMID 24179226 .
  4. ↑ 1 2 3 4 Wang Y. , Waters J. , Leung ML , Unruh A. , Roh W. , Shi X. , Chen K. , Scheet P. , Vattathil S. , Liang H. , Multani A. , Zhang H . , Zhao R. , Michor F. , Meric-Bernstam F. , Navin NE Evoluția clonală în cancerul de sân dezvăluită prin secvențierea genomului cu un singur nucleu.  (engleză)  // Natură. - 2014. - Vol. 512, nr. 7513 . - P. 155-160. - doi : 10.1038/nature13600 . — PMID 25079324 .
  5. ^ Wen L. , Tang F. Secvențierea celulelor unice în biologia celulelor stem.  (engleză)  // Biologia genomului. - 2016. - Vol. 17, nr. 1 . - P. 71. - doi : 10.1186/s13059-016-0941-0 . — PMID 27083874 .
  6. ↑ Bacher R. , Kendziorski C. Design and computational analysis of single-cell ARN-sequencing experiments.  (engleză)  // Biologia genomului. - 2016. - Vol. 17, nr. 1 . - P. 63. - doi : 10.1186/s13059-016-0927-y . — PMID 27052890 .
  7. ↑ Emmert-Buck MR , Bonner RF , Smith PD , Chuaqui RF , Zhuang Z. , Goldstein SR , Weiss RA , Liotta LA Microdisecție cu captură cu laser.  (engleză)  // Știință (New York, NY). - 1996. - Vol. 274, nr. 5289 . - P. 998-1001. — PMID 8875945 .
  8. ↑ HAM RG CREȘTEREA CLONALA A CELULELOR DE MAMIFERE ÎNTR-UN MEDIU DE SINTETIC DEFINIT CHIMIC.  (engleză)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1965. - Vol. 53. - P. 288-293. — PMID 14294058 .
  9. ↑ 1 2 3 4 5 Zong C. , Lu S. , Chapman AR , Xie XS Detectarea la nivel de genom a variațiilor cu o singură nucleotidă și numărul de copii ale unei singure celule umane.  (engleză)  // Știință (New York, NY). - 2012. - Vol. 338, nr. 6114 . - P. 1622-1626. - doi : 10.1126/science.1229164 . — PMID 23258894 .
  10. ^ Gole J. , Gore A. , Richards A. , Chiu YJ , Fung HL , Bushman D. , Chiang HI , Chun J. , Lo YH , Zhang K. Clonarea masivă a polimerazei și secvențierea genomului celulelor individuale folosind microgodeuri de nanolitri.  (engleză)  // Biotehnologia naturii. - 2013. - Vol. 31, nr. 12 . - P. 1126-1132. - doi : 10.1038/nbt.2720 . — PMID 24213699 .
  11. ↑ White AK , VanInsberghe M. , Petriv OI , Hamidi M. , Sikorski D. , Marra MA , Piret J. , Aparicio S. , Hansen CL High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.  (engleză)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - Vol. 108, nr. 34 . - P. 13999-14004. - doi : 10.1073/pnas.1019446108 . — PMID 21808033 .
  12. ↑ Macosko EZ , Basu A. , Satija R. , Nemesh J. , Shekhar K. , Goldman M. , Tirosh I. , Bialas AR , Kamitaki N. , Martersteck EM , Trombetta JJ , Weitz DA , Sanes JR , Shalek AK , Regev A. , McCarroll SA Profilarea expresiei la nivel de genom extrem de paralelă a celulelor individuale folosind picături de nanolitri.  (engleză)  // Cell. - 2015. - Vol. 161, nr. 5 . - P. 1202-1214. - doi : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . — PMID 26000488 .
  13. ^ Thompson AM , Paguirigan AL , Kreutz JE , Radich JP , Chiu DT Microfluidics for single-cell genetic analysis. (Engleză)  // Laborator pe un cip. - 2014. - Vol. 14, nr. 17 . - P. 3135-3142. - doi : 10.1039/c4lc00175c . — PMID 24789374 .  
  14. ↑ Actis P. , Maalouf MM , Kim HJ , Lohith A. , Vilozny B. , Seger RA , Pourmand N. Compartmental genomics in living cells revelat by single-cell nanobiopsy.  (engleză)  // ACS nano. - 2014. - Vol. 8, nr. 1 . - P. 546-553. doi : 10.1021 / nn405097u . — PMID 24279711 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Paez JG , Lin M. , Beroukhim R. , Lee JC , Zhao X. , Richter DJ , Gabriel S. , Herman P. , Sasaki H. , Altshuler D. , Li C. , Meyerson M. , Vânzătorii WR Acoperirea genomului și fidelitatea secvenței amplificării întregului genom cu deplasare multiplă pe bază de polimerază phi29.  (engleză)  // Cercetarea acizilor nucleici. - 2004. - Vol. 32, nr. 9 . — P. e71. - doi : 10.1093/nar/gnh069 . — PMID 15150323 .
  16. ↑ Ausubel, FM și colab. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. PROTOCOLE ACTUALE ÎN BIOLOGIA MOLECULARĂ. — 1995.
  17. ↑ 1 2 3 4 Hou Y. , Wu K. , Shi X. , Li F. , Song L. , Wu H. , Dean M. , Li G. , Tsang S. , Jiang R. , Zhang X. , Li B. , Liu G. , Bedekar N. , Lu N. , Xie G. , Liang H. , Chang L. , Wang T. , Chen J. , Li Y. , Zhang X. , Yang H. , Xu X. , Wang L. , Wang J. Comparația de detecție a variațiilor între metodele de amplificare a întregului genom utilizate în resecvențierea cu o singură celulă.  (engleză)  // GigaScience. - 2015. - Vol. 4. - P. 37. - doi : 10.1186/s13742-015-0068-3 . — PMID 26251698 .
  18. ↑ 1 2 3 4 5 Huang L. , Ma F. , Chapman A. , Lu S. , Xie XS Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications.  (engleză)  // Revizuirea anuală a genomicii și a geneticii umane. - 2015. - Vol. 16. - P. 79-102. - doi : 10.1146/annurev-genom-090413-025352 . — PMID 26077818 .
  19. ↑ Chen M. , Song P. , Zou D. , Hu X. , Zhao S. , Gao S. , Ling F. Comparația între amplificarea cu deplasare multiplă (MDA) și ciclurile multiple de amplificare bazate pe recoacere și buclă (MALBAC) într-un singur -secvențierea celulelor.  (Engleză)  // Public Library of Science ONE. - 2014. - Vol. 9, nr. 12 . - P. e114520. - doi : 10.1371/journal.pone.0114520 . — PMID 25485707 .
  20. ↑ 1 2 3 Gawad C. , Koh W. , Quake SR Secvențierea genomului unic: starea actuală a științei.  (engleză)  // Recenzii de natură. genetica. - 2016. - Vol. 17, nr. 3 . - P. 175-188. - doi : 10.1038/nrg.2015.16 . — PMID 26806412 .
  21. ↑ 1 2 Abecasis GR , Auton A. , Brooks LD , DePristo MA , Durbin RM , Handsaker RE , Kang HM , Marth GT , McVean GA O hartă integrată a variației genetice din 1.092 de genomi umani.  (engleză)  // Natură. - 2012. - Vol. 491, nr. 7422 . - P. 56-65. - doi : 10.1038/nature11632 . — PMID 23128226 .
  22. ^ Martin ER , Lai EH , Gilbert JR , Rogala AR , Afshari AJ , Riley J. , Finch KL , Stevens JF , Livak KJ , Slotterbeck BD , Slifer SH , Warren LL , Conneally PM , Schmechel DE , Pervis I. Vance MA , Roses AD , Vance JM SNPing departe de boli complexe: analiza polimorfismelor cu un singur nucleotide în jurul APOE în boala Alzheimer. (engleză)  // Jurnal american de genetică umană. - 2000. - Vol. 67, nr. 2 . - P. 383-394. - doi : 10.1086/303003 . — PMID 10869235 .  
  23. ↑ Zhu Y. , Spitz MR , Lei L. , Mills GB , Wu X. Un polimorfism de un singur nucleotide în promotorul metaloproteinazei-1 a matricei îmbunătățește susceptibilitatea cancerului pulmonar.  (engleză)  // Cercetarea cancerului. - 2001. - Vol. 61, nr. 21 . - P. 7825-7829. — PMID 11691799 .
  24. ↑ 1 2 Schaschl H. , Aitman TJ , Vyse TJ Variația numărului de copii în genomul uman și implicația sa în autoimunitate.  (engleză)  // Imunologie clinică și experimentală. - 2009. - Vol. 156, nr. 1 . - P. 12-16. - doi : 10.1111/j.1365-2249.2008.03865.x . — PMID 19220326 .
  25. ^ McKenna A. , Hanna M. , Banks E. , Sivachenko A. , Cibulskis K. , Kernytsky A. , Garimella K. , Altshuler D. , Gabriel S. , Daly M. , DePristo MA Setul de instrumente de analiză a genomului: a MapReduce cadru pentru analizarea datelor de secvențiere a ADN-ului de generație următoare. (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2010. - Vol. 20, nr. 9 . - P. 1297-1303. - doi : 10.1101/gr.107524.110 . — PMID 20644199 .  
  26. ^ Zhang J. , Wheeler DA , Yakub I. , Wei S. , Sood R. , Rowe W. , Liu PP , Gibbs RA , Buetow KH SNPdetector: un instrument software pentru detectarea SNP sensibilă și precisă.  (engleză)  // Public Library of Science for Computational Biology. - 2005. - Vol. 1, nr. 5 . - P. e53. - doi : 10.1371/journal.pcbi.0010053 . — PMID 16261194 .
  27. ↑ Li R. , Li Y. , Fang X. , Yang H. , Wang J. , Kristiansen K. , Wang J. Detectarea SNP pentru resecvențierea masivă a întregului genom.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2009. - Vol. 19, nr. 6 . - P. 1124-1132. - doi : 10.1101/gr.088013.108 . — PMID 19420381 .
  28. ↑ Koboldt DC , Chen K. , Wylie T. , Larson DE , McLellan MD , Mardis ER , Weinstock GM , Wilson RK , Ding L. VarScan: varianta detection în masiv paralelă secvențiere a probelor individuale și grupate.  (engleză)  // Bioinformatică. - 2009. - Vol. 25, nr. 17 . - P. 2283-2285. - doi : 10.1093/bioinformatics/btp373 . — PMID 19542151 .
  29. ^ Redon R. , Ishikawa S. , Fitch KR , Feuk L. , Perry GH , Andrews TD , Fiegler H. , Shapero MH , Carson AR , Chen W. , Cho EK , Dallaire S. , Freeman JL , González JR , Gratacòs M. , Huang J. , Kalaitzopoulos D. , Komura D. , MacDonald JR , Marshall CR , Mei R. , Montgomery L. , Nishimura K. , Okamura K. , Shen F. , Somerville MJ , Tchinda J. , Valsesia A . , Woodwark C. , Yang F. , Zhang J. , Zerjal T. , Zhang J. , Armengol L. , Conrad DF , Estivill X. , Tyler-Smith C. , Carter NP , Aburatani H. , Lee C. , Jones KW , Scherer SW , Hurles ME Variația globală a numărului de copii în genomul uman. (engleză)  // Natură. - 2006. - Vol. 444, nr. 7118 . - P. 444-454. - doi : 10.1038/nature05329 . — PMID 17122850 .  
  30. ↑ Zhang F. , Gu W. , Hurles ME , Lupski JR Variația numărului de copii în sănătatea umană, boli și evoluție.  (engleză)  // Revizuirea anuală a genomicii și a geneticii umane. - 2009. - Vol. 10. - P. 451-481. - doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164217 . — PMID 19715442 .
  31. ^ Frank B. , Bermejo JL , Hemminki K. , Sutter C. , Wappenschmidt B. , Meindl A. , Kiechle-Bahat M. , Bugert P. , Schmutzler RK , Bartram CR , Burwinkel B. Varianta de număr de copiere în tumora candidată gena supresoare MTUS1 și riscul de cancer de sân în familie.  (engleză)  // Carcinogeneza. - 2007. - Vol. 28, nr. 7 . - P. 1442-1445. - doi : 10.1093/carcin/bgm033 . — PMID 17301065 .
  32. ↑ Glessner JT , Wang K. , Cai G. , Korvatska O. , Kim CE , Wood S. , Zhang H. , Estes A. , Brune CW , Bradfield JP , Imielinski M. , Frackelton EC , Reichert J. , Crawford EL , Munson J. , Sleiman PM , Chiavacci R. , Annaiah K. , Thomas K. , Hou C. , Glaberson W. , Flory J. , Otieno F. , Garris M. , Soorya L. , Klei L. , Piven J. . , Meyer KJ , Anagnostou E. , Sakurai T. , Game RM , Rudd DS , Zurawiecki D. , McDougle CJ , Davis LK , Miller J. , Posey DJ , Michaels S. , Kolevzon A. , Silverman JM , Bernier R. , Levy SE , Schultz RT , Dawson G. , Owley T. , McMahon WM , Wassink TH , Sweeney JA , Nurnberger JI , Coon H. , Sutcliffe JS , Minshew NJ , Grant SF , Bucan M. , Cook EH , , Buxum EH , , Buxum EH . Devlin B. , Schellenberg GD , Hakonarson H. Variația numărului de copii la nivelul genomului autismului dezvăluie ubiquitina și genele neuronale.  (engleză)  // Natură. - 2009. - Vol. 459, nr. 7246 . - P. 569-573. - doi : 10.1038/nature07953 . — PMID 19404257 .
  33. ↑ Xie C. , Tammi MT CNV-seq, o nouă metodă de detectare a variației numărului de copii folosind secvențierea cu randament ridicat.  (engleză)  // BMC bioinformatics. - 2009. - Vol. 10. - P. 80. - doi : 10.1186/1471-2105-10-80 . — PMID 19267900 .
  34. ^ Wang K. , Li M. , Hadley D. , Liu R. , Glessner J. , Grant SF , Hakonarson H. , Bucan M. PennCNV: un model Markov ascuns integrat, conceput pentru detectarea variației numărului de copii de înaltă rezoluție în întregime date de genotipizare a genomului SNP.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2007. - Vol. 17, nr. 11 . - P. 1665-1674. - doi : 10.1101/gr.6861907 . — PMID 17921354 .
  35. ^ Ivakhno S. , Royce T. , Cox AJ , Evers DJ , Cheetham RK , Tavaré S. CNAseg--un cadru nou pentru identificarea modificărilor numărului de copii în cancer din datele de secvențiere de a doua generație.  (engleză)  // Bioinformatică. - 2010. - Vol. 26, nr. 24 . - P. 3051-3058. - doi : 10.1093/bioinformatics/btq587 . — PMID 20966003 .
  36. ↑ Miller CA , Hampton O. , Coarfa C. , Milosavljevic A. ReadDepth: a parallel R package for detecting copy number alterations from short sequencing reads.  (Engleză)  // Public Library of Science ONE. - 2011. - Vol. 6, nr. 1 . - P. e16327. - doi : 10.1371/journal.pone.0016327 . — PMID 21305028 .
  37. ↑ Klambauer G. , Schwarzbauer K. , Mayr A. , ​​Clevert DA , Mitterecker A. , ​​Bodenhofer U. , Hochreiter S. cn.MOPS: amestec de Poissons pentru descoperirea variațiilor numărului de copii în datele de secvențiere de generație următoare cu o descoperire falsă scăzută rată.  (engleză)  // Cercetarea acizilor nucleici. - 2012. - Vol. 40, nr. 9 . — P. e69. - doi : 10.1093/nar/gks003 . — PMID 22302147 .
  38. ↑ Ning L. , Liu G. , Li G. , Hou Y. , Tong Y. , He J. Provocări actuale în bioinformatica genomicii cu celule unice.  (engleză)  // Frontiere în oncologie. - 2014. - Vol. 4. - P. 7. - doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . — PMID 24478987 .
  39. ^ Eisen MB , Spellman PT , Brown PO , Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.  (engleză)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1998. - Vol. 95, nr. 25 . - P. 14863-14868. — PMID 9843981 .
  40. ^ Prokopenko D. , Hecker J. , Silverman EK , Pagano M. , Nöthen MM , Dina C. , Lange C. , Fier HL Utilizarea indicelui Jaccard pentru a dezvălui stratificarea populației în secvențierea datelor: un studiu de simulare și o aplicație la 1000 Proiectul genomului.  (engleză)  // Bioinformatică. - 2016. - Vol. 32, nr. 9 . - P. 1366-1372. - doi : 10.1093/bioinformatics/btv752 . — PMID 26722118 .
  41. ↑ Greaves M. , Maley C. C. Clonal evolution in cancer.  (engleză)  // Natură. - 2012. - Vol. 481, nr. 7381 . - P. 306-313. - doi : 10.1038/nature10762 . — PMID 22258609 .
  42. ↑ A.P. Dempster; NM Laird; D.B. Rubin. Probabilitate maximă de la date incomplete prin algoritmul EM  // Journal of the Royal Statistical Society. Seria B (Metodologic). - 1977. - Vol. 39, nr. 1 . - P. 1-38. - doi : 10.2307/2984875 . Arhivat din original pe 11 decembrie 2015.
  43. ↑ C. Fraley, A. E. Raftery. Câte clustere? Ce metodă de grupare? Răspunsuri prin analiza  cluster bazată pe model . - 1998. - doi : 10.1093/comjnl/41.8.578 . Arhivat din original pe 22 februarie 2017.
  44. ↑ Chris Fraley, Adrian E. Raftery. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis  (engleză)  // Journal of Classification. - 1999. - doi : 10.1007/s003579900058 . Arhivat din original pe 22 iulie 2017.
  45. ↑ 1 2 Kim KI , Simon R. Utilizarea datelor de secvențiere a unei singure celule pentru a modela istoria evolutivă a unei tumori.  (engleză)  // BMC bioinformatics. - 2014. - Vol. 15. - P. 27. - doi : 10.1186/1471-2105-15-27 . — PMID 24460695 .
  46. ↑ Falconer E. , Hills M. , Naumann U. , Poon SS , Chavez EA , Sanders AD , Zhao Y. , Hirst M. , Lansdorp PM DNA template strand sequencing of single-cell maps rearanjamente genomice la rezoluție înaltă.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2012. - Vol. 9, nr. 11 . - P. 1107-1112. - doi : 10.1038/nmeth.2206 . — PMID 23042453 .
  47. ↑ Falconer E. , Lansdorp PM Strand-seq: un instrument de unificare pentru studiile segregării cromozomilor.  (engleză)  // Seminarii de biologie celulară și dezvoltare. - 2013. - Vol. 24, nr. 8-9 . - P. 643-652. - doi : 10.1016/j.semcdb.2013.04.005 . — PMID 23665005 .
  48. ↑ Coupland P. , Chandra T. , Quail M. , Reik W. , Swerdlow H. Secvențierea directă a genomilor mici pe Pacific Biosciences RS fără pregătirea bibliotecii.  (engleză)  // BioTehnici. - 2012. - Vol. 53, nr. 6 . - P. 365-372. - doi : 10.2144/000113962 . — PMID 23227987 .
  49. ↑ El Hajj N. , Trapphoff T. , Linke M. , May A. , Hansmann T. , Kuhtz J. , Reifenberg K. , Heinzmann J. , Niemann H. , Daser A. , Eichenlaub -Ritter U. , Zechner U. . , Haaf T. Limitarea secvențierii bisulfitului de diluție (piro) dezvăluie modele de metilare specifice părintelui în embrioni de șoarece timpurii și ovocite bovine.  (engleză)  // Epigenetică. - 2011. - Vol. 6, nr. 10 . - P. 1176-1188. - doi : 10.4161/epi.6.10.17202 . — PMID 21937882 .
  50. ↑ Guo H. , Zhu P. , Wu X. , Li X. , Wen L. , Tang F. Peisaje de metilom cu o singură celulă ale celulelor stem embrionare de șoarece embrionare și embrioni timpurii analizați folosind secvențierea bisulfiților cu reprezentare redusă.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2013. - Vol. 23, nr. 12 . - P. 2126-2135. - doi : 10.1101/gr.161679.113 . — PMID 24179143 .
  51. ↑ Nagano T. , Lubling Y. , Yaffe E. , Wingett SW , Dean W. , Tanay A. , Fraser P. Single-cell Hi-C for genom-wide detecting of chromatin interacts that are simultaneous in a single cell.  (engleză)  // Nature protocols. - 2015. - Vol. 10, nr. 12 . - P. 1986-2003. - doi : 10.1038/nprot.2015.127 . — PMID 26540590 .
  52. ↑ 1 2 Macaulay IC , Voet T. Single cell genomics: advances and future perspectives.  (Engleză)  // Genetica PLoS. - 2014. - Vol. 10, nr. 1 . — P. e1004126. - doi : 10.1371/journal.pgen.1004126 . — PMID 24497842 .