Fosfataza alcalină | |
---|---|
Dimer de fosfatază alcalină bacteriană. Capătul N-terminal este marcat cu albastru, capătul C-terminal este marcat cu roșu [1] . | |
Notaţie | |
CAS | 9001-78-9 |
Informații în Wikidata ? |
Fosfataza alcalină | |
---|---|
Structura fosfatazei alcaline [1] . | |
Identificatori | |
Simbol | Alk_fosfatază |
Pfam | PF00245 |
InterPro | IPR001952 |
INTELIGENT | SM00098 |
PROZITA | PDOC00113 |
SCOP | 1alk |
SUPERFAMILIE | 1alk |
Structuri proteice disponibile | |
Pfam | structurilor |
PDB | RCSB PDB ; PDBe ; PDBj |
PDBsum | Model 3D |
Fișiere media la Wikimedia Commons |
Fosfataza alcalină ( Alkaline phosphatase, ALP, ALKP ) este o enzimă hidrolază ( EC 3.1.3.1 ) care scindează fosfatul (defosforilarea) din multe tipuri de molecule, cum ar fi nucleotide , proteine și alcaloizi . Este o enzimă proteică homodimerică care cântărește 86 kilodaltoni. Fiecare monomer conține cinci reziduuri de cisteină, doi atomi de zinc și un atom de magneziu, care sunt esențiale pentru funcția sa catalitică [2] . Enzima este cea mai activă într- un mediu alcalin [3] .
Enzima catalizează următoarea reacție:
fosfat monoester + H 2 O = alcool + fosfatFosfatazele alcaline acționează ca compuși defosforilanti. Enzima apare într-o varietate de organisme, atât procariote , cât și eucariote , cu aceeași funcție generală, dar în forme structurale diferite pentru a se potrivi mediului în care funcționează. Fosfataza alcalina se gaseste in spatiul periplasmatic al bacteriilor E. coli . Această enzimă este termostabilă și are activitate maximă la pH ridicat. La om, apare sub mai multe forme în funcție de originea sa în organism - joacă un rol important în metabolismul ficatului și dezvoltarea scheletului. Datorită distribuției sale largi în aceste zone, concentrația sa în fluxul sanguin este folosită de diagnosticieni ca biomarker pentru a determina diagnostice precum hepatita sau osteomalacia [4] .
Nivelul fosfatazei alcaline din sânge este verificat cu ajutorul testului ALP, care este adesea inclus în testele de sânge de rutină. Nivelul acestei enzime în sânge depinde de factori precum vârsta, sexul sau grupa sanguină [5] . Nivelul fosfatazei alcaline din sânge crește, de asemenea, de două până la patru ori în timpul sarcinii. Acest lucru se întâmplă ca urmare a fosfatazei alcaline suplimentare produsă de placentă. În plus, nivelurile anormale de fosfatază alcalină din sânge pot indica probleme legate de ficat, vezica biliară sau oase. Tumorile și infecțiile renale, precum și malnutriția, au arătat, de asemenea, niveluri anormale de fosfatază alcalină în sânge [6] .
Fosfataza alcalină este o enzimă homodimerică , adică este formată din două molecule. Trei ioni metalici, doi Zn și unul Mg, se găsesc în situsurile catalitice și ambele tipuri sunt critice pentru activitatea enzimatică. Enzimele catalizează hidroliza monoesterilor în acid fosforic , care poate cataliza suplimentar reacția de transfosforilare cu concentrații mari de acceptori de fosfat.
Fosfataza alcalină are omologie într-un număr mare de alte enzime și face parte dintr-o superfamilie de enzime cu mai multe aspecte catalitice suprapuse și caracteristici de substrat. Studiile au arătat o relație între membrii familiei fosfatazelor alcaline și arilsulfataze. Asemănarea în structură indică faptul că aceste două familii de enzime descind dintr-un strămoș comun. Analize ulterioare au legat fosfații alcalini și arilsulfatazele de o superfamilie mai mare . Unele dintre genele comune găsite în această superfamilie codifică fosfodiesteraze , precum și o autotoxină .
În bacteriile gram-negative, cum ar fi Escherichia coli , fosfataza alcalină este situată în spațiul periplasmatic, în afara membranei celulare interioare și în interiorul porțiunii peptidoglicane a peretelui celular. Deoarece spațiul periplasmatic este mai susceptibil la schimbările de mediu decât celula interioară, fosfataza alcalină este în consecință rezistentă la inactivare, denaturare sau degradare. Această caracteristică a enzimei este neobișnuită pentru multe alte proteine [7] .
Structura și funcția precisă a izoenzimei din E. coli sunt destinate exclusiv să furnizeze o sursă de fosfat anorganic atunci când mediul nu are acest metabolit. Fosfații anorganici se leagă apoi de proteinele purtătoare care furnizează fosfații anorganici la un sistem de transport specific, de mare afinitate, cunoscut sub numele de sistem de transport specific fosfatului (sistemul Pst), care transportă fosfatul prin membrana citoplasmatică [8] .
Când mai multe copii ale unei polipeptide codificate de o genă formează un agregat, această structură proteică se numește multimer. Când un multimer este format din polipeptide produse de două alele mutante diferite ale unei anumite gene, multimerul mixt poate prezenta o activitate funcţională mai mare decât multimerii neamestecaţi formaţi de fiecare dintre mutanţi în mod individual. În acest caz, acest fenomen se numește complementare intragenică. Fosfataza alcalină de E. coli , o enzimă dimerică, prezintă complementare intragenică [9] . Când anumite versiuni mutante ale fosfatazei alcaline au fost combinate, enzimele heterodimerice rezultate au prezentat un nivel de activitate mai mare decât s-ar fi așteptat pe baza activității relative a enzimelor părinte. Aceste rezultate au indicat că structura dimerică a fosfatazei alcaline de E. coli permite interacțiuni de cooperare între monomerii constituenți care pot genera o formă mai funcțională a holoenzimei.
Enzima izolată din bacteria Escherichia coli are un pH optim de 8,0 [10] , în timp ce enzima izolată din pulpa de bovină are un pH optim de aproximativ 8,5 [11] .
Prin modificarea aminoacizilor enzimei fosfatazei alcaline de tip sălbatic produsă de Escherichia coli, se creează o fosfatază alcalină mutantă care nu numai că mărește activitatea enzimei de 36 de ori, dar menține și stabilitatea termică [12] . O utilizare tipică de laborator a fosfatazelor alcaline implică îndepărtarea monoesterilor de fosfat pentru a preveni auto-ligarea, ceea ce este nedorit în clonarea ADN-ului plasmid [13] .
Fosfatazele alcaline utilizate în cercetare includ:
Fosfataza alcalină intestinală umană prezintă aproximativ 80% omologie cu enzima intestinală a bovinelor, ceea ce confirmă originea lor evolutivă comună. Aceeași enzimă bovină are peste 70% omologie cu enzima placentară umană. Cu toate acestea, enzima intestinală umană și enzima placentară au doar 20% omologie, în ciuda asemănării lor structurale [16] .
Fosfataza alcalină este utilizată în cercetarea în biologie moleculară pentru a desprinde grupările de fosfat la capătul 5’ și pentru a preveni legarea acestor capete. Îndepărtarea fosfaților terminali permite, de asemenea, introducerea unei etichete radioactive terminale. Cea mai utilizată este fosfataza alcalină de creveți, care este și cea mai ușor inactivată după scindarea fosfatului.
Fosfataza alcalină este, de asemenea, utilizată pe scară largă în imunotestul enzimatic ca etichetă.
Celulele stem pluripotente nediferențiate au niveluri ridicate de fosfatază alcalină pe membrana lor celulară, astfel încât colorarea cu fosfatază alcalină este utilizată pentru a detecta aceste celule și a verifica pluripotența (adică, celule stem embrionare sau celule de carcinom embrionar) [17] .
Există o corelație pozitivă între nivelul seric al fosfatazei alcaline și formarea osoasă la om, deși utilizarea sa ca biomarker în practica clinică nu este recomandată [18] .
Cercetătorii moderni studiază creșterea factorului de necroză tumorală-α și efectul său direct asupra expresiei fosfatazei alcaline în celulele musculare netede vasculare, precum și modul în care fosfataza alcalină (AP) afectează răspunsurile inflamatorii și poate juca un rol direct în prevenirea afectarii organelor. [19] .
Fosfataza alcalină este folosită în mod obișnuit în industria laptelui ca indicator al pasteurizării de succes. Acest lucru se datorează faptului că cea mai tolerantă bacterie găsită în lapte, Mycobacterium paratuberculosis , este distrusă la temperaturi mai scăzute decât cele necesare pentru denaturarea enzimei. Prin urmare, prezența sa este ideală pentru a indica o pasteurizare eșuată [23] [24] .
Testarea de pasteurizare se face de obicei prin măsurarea fluorescenței unei soluții care devine fluorescentă atunci când este expusă la fosfatază alcalină activă. Producătorii de lapte din Marea Britanie solicită teste fluorimetrice pentru a demonstra că fosfataza alcalină a fost denaturată [25] , deoarece testele pentru p-nitrofenil fosfat nu sunt considerate suficient de precise pentru a îndeplini standardele de sănătate.
Alternativ, schimbarea culorii p -nitrofenil fosfat poate fi folosită ca substrat într-o soluție tampon (testul Aschaffenburg-Mullen) [26] . Laptele crud capătă de obicei o culoare galbenă în câteva minute, în timp ce laptele pasteurizat corespunzător nu ar trebui să prezinte nicio schimbare. Exista si exceptii de la aceasta regula, ca in cazul fosfatazelor alcaline termostabile produse de anumite bacterii, insa aceste bacterii nu trebuie sa fie prezente in lapte.
Toate izoenzimele fosfatazei alcaline de la mamifere, cu excepția placentare (PALP și SEAP) sunt inhibate de homoarginină și, în mod similar, toate, cu excepția intestinală și placentară, sunt blocate de levamisol [27] . Fosfatul este un alt inhibitor care inhibă competitiv fosfataza alcalină [28] .
Un alt exemplu binecunoscut de inhibitor al fosfatazei alcaline este acidul [(4-nitrofenil)metil]fosfonic [29] .
În solul contaminat cu metale, fosfataza alcalină este inhibată de Cd (cadmiu). În plus, temperatura îmbunătățește inhibarea activității Cd a enzimei, care se manifestă printr-o creștere a valorilor Km [ 30] .
Încălzirea timp de 2 ore la 65°C inactivează majoritatea izoenzimelor, cu excepția izoformelor placentare (PALP și SEAP).
La om, fosfataza alcalină este prezentă în toate țesuturile, în special în ficat, canale biliare, rinichi, oase și placentă. Două tipuri de izoenzime ale fosfatazei alcaline predomină în serul sanguin: scheletice și hepatice. În copilărie, majoritatea fosfatazelor alcaline sunt de origine scheletică [31] .
Următoarele izoenzime se găsesc la oameni și la alte mamifere:
Patru gene codifică patru izoenzime. Gena fosfatazei alcaline nespecifice tisulare este localizata pe cromozomul 1, iar genele celorlalte trei izoforme sunt localizate pe cromozomul 2 [2] .
Fosfataza alcalină intestinală (IAP)Fosfataza alcalină intestinală este secretată de enterocite și pare să joace un rol cheie în homeostazia și protecția intestinală [32] [33] precum și în suprimarea inflamației [34] prin reglarea descendentă dependentă de receptorul Toll-like (TLR)-4. și cascada inflamatorie dependentă de MyD88 [35] . Defosforilează liganzii microbieni toxici/inflamatori, cum ar fi lipopolizaharidele (LPS) [36] , dinucleotidele citozină-guanină nemetilate, flagelina și nucleotidele extracelulare, cum ar fi uridin difosfat sau ATP. Defosforilarea LPS prin IAP poate reduce severitatea infecțiilor cu Salmonella tryphimurium și Clostridioides difficile și poate restabili microbiota intestinală normală [36] . Astfel, expresia alterată a IAP a fost implicată în bolile inflamatorii cronice, cum ar fi boala inflamatorie intestinală (IBD) [36] [37] . De asemenea, pare să regleze absorbția lipidelor [38] și secreția de bicarbonat [39] în mucoasa duodenală, care reglează pH-ul de suprafață.
Nivelul normal al fosfatazei alcaline este de 44 până la 147 UI/L [40] . Nivelul fosfatazei alcaline crește odată cu blocarea căii biliare [41] . Concentrațiile la copii și femeile însărcinate sunt mult mai mari. Un nivel scăzut de fosfatază alcalină este mult mai puțin frecvent decât un nivel crescut. Un nivel redus de fosfatază alcalină este principalul indicator al hipofosfataziei (o boală osoasă rară), care se caracterizează prin afectarea formării scheletului, întârzierea dezvoltării fizice, fracturi etc.
Contraceptivele orale reduc nivelul fosfatazei alcaline [42] .
![]() |
---|
Enzime | |
---|---|
Activitate | |
Regulament | |
Clasificare | |
Tipuri |
|
Hidrolaze ( EC 3): esteraze ( EC 3.1) | |||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
EC 3.1.1: Hidrolaze ale esterilor carboxilici | |||||||||||||||
EC 3.1.2: Tioesteraze |
| ||||||||||||||
EC 3.1.3: Fosfataze |
| ||||||||||||||
EC 3.1.4: Fosfodiesteraze |
| ||||||||||||||
EC 3.1.6: Sulfatază |
| ||||||||||||||
Nucleaze (inclusiv deoxiribonucleaze și ribonucleaze ) |
|