ATAC secv

ATAC-seq (din engleză.  A ssay for T ransposase -Accessible C hromatin using seq uencing ) este o metodă pentru evaluarea genomică a întregului grad de deschidere a cromatinei [1] . Metoda a apărut în 2013 ca alternativă la MNase-seq ( secvențierea site-urilor accesibile nucleazei micrococice ), FAIRE-Seq și DNase-seq [1] . Comparativ cu DNase-seq și MNase-seq, ATAC-seq este o metodă mai rapidă și mai sensibilă pentru analiza epigenomului [2] [3] [4] .

Descriere

ATAC-seq detectează regiunile ADN expuse din cromatina folosind o formă mutantă hiperactivă a transpozazei Tn5 , care inserează adaptori de secvențiere în regiunile expuse ale genomului [2] [5] . În timp ce transpozazele de tip sălbatic tind să aibă activitate scăzută, enzima utilizată în ATAC-seq are o activitate crescută [6] . În timpul procesului de tagmentare, transpozaza  Tn5 introduce rupturi dublu-catenar în regiunile deschise ale genomului și inserează adaptori de secvențiere în rupturi [7] . Fragmentele de ADN care conțin adaptori sunt apoi purificate, amplificate prin reacția în lanț a polimerazei și secvențiate folosind metode de secvențiere de generație următoare [7] . Pe baza citirilor obținute ca rezultat al secvențierii, este posibil să se identifice regiunile cromatinei deschise , situsurile de legare a factorului de transcripție , precum și pozițiile nucleozomilor [2] . Cu cât cromatina este mai deschisă, cu atât mai multe citiri cad pe regiunea corespunzătoare a genomului, iar acuratețea unei astfel de evaluări ajunge la o valoare de o nucleotidă [2] . Spre deosebire de FAIRE-seq, ATAC-seq nu necesită sonicare sau extracție cu fenol și cloroform [8] ; spre deosebire de ChIP-seq, această metodă nu necesită utilizarea anticorpilor [9] sau tăierea ADN-ului cu enzime speciale, ca în cazul metodelor DNase-seq și MNase-seq [10] . Pregătirea probei pentru ATAC-seq durează doar aproximativ trei ore [11] .

Aplicație

ATAC-seq este utilizat pentru a cuantifica regiunile cromatinei deschise. Cel mai adesea, această metodă este folosită în experimente pentru a stabili poziția nucleozomilor [3] , cu toate acestea, poate fi folosită pentru a identifica locurile de legare pentru factorii de transcripție [12] și situsurile de metilare a ADN [13] . ATAC-seq poate fi utilizat pentru a localiza amplificatori , de exemplu, în studiile de evoluție a amplificatorului [14] sau pentru a identifica potențiatori specifici care funcționează în timpul diferențierii celulelor sanguine [15] .

ATAC-seq a fost utilizat pentru detectarea la nivelul întregului genom a regiunilor active de cromatina în diferite celule canceroase umane [16] . Folosind această metodă, s-a demonstrat o scădere generală a numărului de regiuni cromatine deschise în degenerescența maculară [17] . ATAC-seq poate fi utilizat pentru a identifica situsurile de legare a proteinelor specifice acestor celule , precum și factorii de transcripție cu activitate specifică în diferite tipuri de celule [12] .

ATAC-seq celule unice

Există modificări ale protocolului ATAC-seq concepute pentru analiza cromatinei în celule individuale. Cu ajutorul abordărilor microhidrodinamice , este posibil să se izoleze nuclee celulare individuale și deja pe ele să se producă ATAC-seq [11] . În această abordare, izolarea celulelor individuale are loc înainte de introducerea adaptoarelor pentru secvențiere în genom [11] [18] . O altă abordare, cunoscută sub numele de indexare combinatorie a celulelor, nu necesită izolarea celulelor individuale. Această metodă utilizează coduri de bare pentru a evalua disponibilitatea cromatinei în mii de celule . Într-un astfel de experiment, este posibil să se obțină un profil epigenomic pentru 10.000–100.000 de celule [19] . Cu toate acestea, indexarea combinatorie a celulelor necesită echipamente complexe suplimentare și o formă specială de transpozază Tn5 [20] .

Analiza bioinformatică a datelor ATAC-seq cu o singură celulă se bazează pe construcția unei matrice în care regiunile cromatinei sunt opuse numărului de citiri care au căzut pe ele. Astfel de matrici pot fi foarte mari și pot conține sute de mii de regiuni cromatinei, cu un număr diferit de zero de citiri reprezentând nu mai mult de 3% dintre ele [21] . La fel ca standardul ATAC-seq, ATAC-seq cu o singură celulă face posibilă identificarea factorilor de transcripție activi într-o celulă dată, de exemplu, prin analizarea numărului de citiri la locurile lor de legare [22] .

Note

  1. ↑ 1 2 Buenrostro JD , Giresi PG , Zaba LC , Chang HY , Greenleaf WJ Transpunerea cromatinei native pentru profilarea epigenomică rapidă și sensibilă a cromatinei deschise, a proteinelor de legare la ADN și a poziției nucleozomului.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2013. - Decembrie ( vol. 10 , nr. 12 ). - P. 1213-1218 . - doi : 10.1038/nmeth.2688 . — PMID 24097267 .
  2. ↑ 1 2 3 4 Buenrostro JD , Wu B. , Chang HY , Greenleaf WJ ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.  (Engleză)  // Current Protocols In Molecular Biology. - 2015. - 5 ianuarie ( vol. 109 ). - P. 21-29 . - doi : 10.1002/0471142727.mb2129s109 . — PMID 25559105 .
  3. ↑ 1 2 Schep AN , Buenrostro JD , Denny SK , Schwartz K. , Sherlock G. , Greenleaf WJ Amprentele nucleozomilor structurate permit maparea de înaltă rezoluție a arhitecturii cromatinei în regiunile de reglementare.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2015. - noiembrie ( vol. 25 , nr. 11 ). - P. 1757-1770 . - doi : 10.1101/gr.192294.115 . — PMID 26314830 .
  4. ↑ Song L. , Crawford GE DNase-seq: o tehnică de înaltă rezoluție pentru cartografierea elementelor de reglare a genelor active de-a lungul genomului din celulele de mamifere.  (ing.)  // Protocoale Cold Spring Harbor. - 2010. - Februarie ( vol. 2010 , nr. 2 ). - P. 5384-5384 . - doi : 10.1101/pdb.prot5384 . — PMID 20150147 .
  5. ↑ Bajic, Marko; Maher, Kelsey A.; Deal, Roger B. Identificarea regiunilor deschise de cromatina în genomii plantelor utilizând ATAC-Seq // Dinamica cromatinei plantelor  (nedefinită) . - 2018. - T. 1675. - S. 183-201. — (Metode în biologie moleculară). - ISBN 978-1-4939-7317-0 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7318-7_12 .
  6. ↑ Reznikoff WS Transposon Tn5.  (Engleză)  // Revizuirea anuală a geneticii. - 2008. - Vol. 42 . - P. 269-286 . - doi : 10.1146/annurev.genet.42.110807.091656 . — PMID 18680433 .
  7. ↑ 1 2 Picelli S. , Björklund AK , Reinius B. , Sagasser S. , Winberg G. , Sandberg R. Proceduri de transpunere și tagmentare Tn5 pentru proiecte de secvențiere la scară masivă.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2014. - Decembrie ( vol. 24 , nr. 12 ). - P. 2033-2040 . - doi : 10.1101/gr.177881.114 . — PMID 25079858 .
  8. ↑ Simon JM , Giresi PG , Davis IJ , Lieb JD . Utilizarea izolației asistate de formaldehidă a elementelor de reglementare (FAIRE) pentru a izola ADN-ul de reglementare activ.  (engleză)  // Nature protocols. - 2012. - Vol. 7, nr. 2 . - P. 256-267. - doi : 10.1038/nprot.2011.444 . — PMID 22262007 .
  9. ^ Savic D. , Partridge EC , Newberry KM , Smith SB , Meadows SK , Roberts BS , Mackiewicz M. , Mendenhall EM , Myers RM CETCh-seq: CRISPR epitope tagging ChIP-seq of DNA-binding proteins.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2015. - octombrie ( vol. 25 , nr. 10 ). - P. 1581-1589 . - doi : 10.1101/gr.193540.115 . — PMID 26355004 .
  10. ↑ Hoeijmakers, Wieteke Anna Maria; Bartfai, Richard. Caracterizarea peisajului nucleozomal prin secvențierea nucleazei micrococice (MNase-seq) // Imunoprecipitarea cromatinei  (neopr.) . - 2018. - T. 1689. - S. 83-101. — (Metode în biologie moleculară). — ISBN 978-1-4939-7379-8 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_8 .
  11. ↑ 1 2 3 Buenrostro JD , Wu B. , Litzenburger UM , Ruff D. , Gonzales ML , Snyder MP , Chang HY , Greenleaf WJ Accesibilitatea cromatinei unicelulare dezvăluie principiile variației de reglementare.  (engleză)  // Natură. - 2015. - 23 iulie ( vol. 523 , nr. 7561 ). - P. 486-490 . - doi : 10.1038/nature14590 . — PMID 26083756 .
  12. ↑ 1 2 Li Z. , Schulz MH , Look T. , Begemann M. , Zenke M. , Costa IG Identificarea situsurilor de legare a factorului de transcripție folosind ATAC-seq.  (engleză)  // Biologia genomului. - 2019. - 26 februarie ( vol. 20 , nr. 1 ). - P. 45-45 . - doi : 10.1186/s13059-019-1642-2 . — PMID 30808370 .
  13. ↑ Spektor R. , Tippens ND , Mimoso CA , Soloway PD metil-ATAC-seq măsoară metilarea ADN-ului la cromatina accesibilă.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2019. - Iunie ( vol. 29 , nr. 6 ). - P. 969-977 . - doi : 10.1101/gr.245399.118 . — PMID 31160376 .
  14. ↑ Prescott SL , Srinivasan R. , Marchetto MC , Grishina I. , Narvaiza I. , Selleri L. , Gage FH , Swigut T. , Wysocka J. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and cimpanzei neuronal crest.  (engleză)  // Cell. - 2015. - 24 septembrie ( vol. 163 , nr. 1 ). - P. 68-83 . - doi : 10.1016/j.cell.2015.08.036 . — PMID 26365491 .
  15. ↑ Lara-Astiaso D. , Weiner A. , Lorenzo-Vivas E. , Zaretsky I. , Jaitin DA , David E. , Keren-Shaul H. , Mildner A. , Winter D. , Jung S. , Friedman N. . Amit I. Imunogenetica. Dinamica stării cromatinei în timpul formării sângelui.  (engleză)  // Știință (New York, NY). - 2014. - 22 august ( vol. 345 , nr. 6199 ). - P. 943-949 . - doi : 10.1126/science.1256271 . — PMID 25103404 .
  16. ↑ Corces MR , Granja JM , Shams S. , Louie BH , Seoane JA , Zhou W. , Silva TC , Groeneveld C. , Wong CK , Cho SW , Satpathy AT , Mumbach MR , Hoadley KA , Robertson AG , Sheffield NC , Felau NC I. , Castro MAA , Berman BP , Staudt LM , Zenklusen JC , Laird PW , Curtis C. , Cancer Genome Atlas Analysis Network. , Greenleaf WJ , Chang HY Peisajul accesibilității cromatinei a cancerelor umane primare.  (engleză)  // Știință (New York, NY). - 2018. - 26 octombrie ( vol. 362 , nr. 6413 ). - doi : 10.1126/science.aav1898 . — PMID 30361341 .
  17. ^ Wang J. , Zibetti C. , Shang P. , Sripathi SR , Zhang P. , Cano M. , Hoang T. , Xia S. , Ji H. , Merbs SL , Zack DJ , Handa JT , Sinha D. , Blackshaw S. , Qian J. Analiza ATAC-Seq relevă o scădere pe scară largă a accesibilității cromatinei în degenerescenta maculară legată de vârstă. (engleză)  // Nature Communications. - 2018. - 10 aprilie ( vol. 9 , nr. 1 ). - P. 1364-1364 . - doi : 10.1038/s41467-018-03856-y . — PMID 29636475 .  
  18. ↑ Mezger A. , Klemm S. , Mann I. , Brower K. , Mir A. , Bostick M. , Farmer A. , Fordyce P. , Linnarsson S. , Greenleaf W. Profilul de accesibilitate a cromatinei de mare performanță la o singură celulă rezoluţie.  (engleză)  // Nature Communications. - 2018. - 7 septembrie ( vol. 9 , nr. 1 ). - P. 3647-3647 . - doi : 10.1038/s41467-018-05887-x . — PMID 30194434 .
  19. ^ Lareau CA , Duarte FM , Chew JG , Kartha VK , Burkett ZD , Kohlway AS , Pokholok D. , Aryee MJ , Steemers FJ , Lebofsky R. , Buenrostro JD .  (Engleză)  // Nature Biotechnology. - 2019. - august ( vol. 37 , nr. 8 ). - P. 916-924 . - doi : 10.1038/s41587-019-0147-6 . — PMID 31235917 .
  20. ↑ Chen X. , Miragaia RJ , Natarajan KN , Teichmann SA O metodă rapidă și robustă pentru profilarea accesibilității cromatinei cu o singură celulă.  (engleză)  // Nature Communications. - 2018. - 17 decembrie ( vol. 9 , nr. 1 ). - P. 5345-5345 . - doi : 10.1038/s41467-018-07771-0 . — PMID 30559361 .
  21. ↑ Li Zhijian , Kuppe Christoph , Cheng Mingbo , Menzel Sylvia , Zenke Martin , Kramann Rafael , Costa Ivan G. scOpen: chromatin-accessibility estimation of single-cell ATAC  data . - 2019. - 5 decembrie. - doi : 10.1101/865931 .
  22. ↑ Schep AN , Wu B. , Buenrostro JD , Greenleaf WJ chromVAR: deducerea accesibilității asociate cu factorul de transcripție din datele epigenomice unicelulare.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2017. - octombrie ( vol. 14 , nr. 10 ). - P. 975-978 . - doi : 10.1038/nmeth.4401 . — PMID 28825706 .