Reacțiile bioortogonale sunt reacții chimice care pot avea loc în sistemele vii fără a interfera cu procesele biochimice naturale [1] [2] [3] . Grupurile funcționale implicate în reacțiile bioortogonale, de regulă, nu se găsesc în biomolecule, reacționează rapid și selectiv între ele în condițiile celulelor vii și sunt inerte față de alți compuși care sunt prezenți în organism. Termenul a fost propus de Caroline Bertozzi în 2003 [4] . Numele reacțiilor se bazează pe sensul figurat al cuvântului „ ortogonal ”, adică independent de orice, și denotă independența reciprocă a fluxului proceselor artificiale și naturale.
În ciuda faptului că în domeniul chimiei organice au fost descoperite, studiate și descrise un număr mare de reacții chimice, practic niciuna dintre ele nu poate fi efectuată într-o celulă sau organism astfel încât să afecteze doar compusul de interes pentru cercetător ( proteină , ADN , metabolit etc.). Acest lucru se întâmplă deoarece biomoleculele conțin un număr mare de grupe funcționale foarte asemănătoare ca reactivitate (în principal nucleofile ), iar reacția în care intră compusul studiat va afecta inevitabil alte molecule care conțin grupări funcționale similare, care nu numai că pot să nu îndeplinească obiectivele studiază, dar și perturbă activitatea naturală a celulei, făcând imposibilă studierea acesteia [5] . În același timp, desfășurarea reacțiilor chimice în interiorul celulei este un instrument de cercetare util, deoarece vă permite să etichetați biomoleculele studiate cu etichete fluorescente , de afinitate și spectrometrie de masă , ceea ce va permite ulterior observarea acestor biomolecule prin metode de cercetare adecvate, de exemplu, folosind un microscop fluorescent . Reacțiile bioortogonale sunt concepute pentru a umple acest gol, deoarece sunt absolut străine celulei, apar între grupuri funcționale introduse artificial și au un efect redus asupra funcționării celulei [3] .
Utilizarea reacției bioortogonale în practică este de obicei realizată în două etape. În primul rând, compusul studiat este modificat cu un grup funcțional bioortogonal în interiorul celulei. Apoi, o etichetă cu greutate moleculară mică care conține o grupare funcțională complementară este introdusă în sistem și, ca urmare a unei reacții bioortogonale, are loc o modificare selectivă (marcare) a acestui compus [3] [5] . Ulterior, eticheta introdusă vă permite să monitorizați substratul modificat.
Reacțiile bioortogonale au făcut acum posibilă studierea diferitelor biomolecule , cum ar fi glicanii , proteinele [6] și lipidele [7] , în timp real în sistemele vii, în absența citotoxicității . Au fost dezvoltate mai multe reacții chimice care îndeplinesc cerințele de bioortogonalitate, printre care cicloadiția 1,3-dipolară azidelor la ciclooctine (numită și reacție clic fără cupru ) [8] , nitroni la ciclooctile [9] ] , formarea de oxime sau hidrazone din compuși carbonilici [10] , reacția tetrazinelor cu ciclooctenele [11] , reacția click a izonitrililor și ligatura cu quadriciclani [13] .
Prima observație a modificării covalente selective folosind o reacție chimică în condițiile celulare a apărut în lucrările lui R. Qian și colab., care au folosit fluoresceină cu două grupe funcționale de arsenă pentru a modifica selectiv o proteină în care se află un fragment de tetracisteină , care este practic. absent în proteinele de mamifere , a fost introdus anterior [14] . Această abordare a făcut posibilă introducerea unei mici etichete fluorescente în proteină, în timp ce metoda standard de atunci era obținerea de hibrizi cu proteina verde fluorescentă sau analogii acesteia [15] , care sunt mult mai mari și, ca urmare, uneori interferează cu funcționarea normală a proteinei studiate.
Această abordare i-a determinat pe chimiști să caute reacții chimice și grupuri funcționale care sunt absolut străine de compușii naturali, iar biologii să inventeze modalități de a introduce funcții bioortogonale în biomolecule. Primul pas a fost realizarea faptului că biomoleculele conțin în principal grupări nucleofile , în timp ce grupările electrofile sunt mult mai puțin frecvente în ele. De exemplu, cetonele și aldehidele nu se găsesc în proteine, în timp ce, în același timp, prezintă reactivitate față de grupările hidrazide și hidroxiamină, care, de asemenea, nu apar în biomolecule. Datorită acestui fapt, la sfârșitul anilor 1990, modificarea glicanilor și proteinelor prin zaharuri și aminoacizi care conțin cetone introduse metabolic a devenit posibilă în interiorul celulei. Cetonele și aldehidele au fost însă prezente în metaboliții cu greutate moleculară mică (zaharuri, piruvat , piridoxal fosfat etc.), adică nu erau complet bioortogonali [16] .
Ulterior, chimiștii au căutat reacții bioortogonale care au loc între grupuri funcționale complet nenaturale. Reacția Staudinger a fost prima reacție chimică adaptată pentru a efectua modificări în interiorul celulei. Gruparea azidă care intră în această reacție aparține electrofililor moi, care nu sunt capabili să reacționeze cu nucleofilele dure cele mai comune în natură. Partenerul pentru azidă a fost fosfina, un nucleofil moale propus de G. Staudinger în 1919 [17] . În 2000, reacția Staudinger a fost modificată de C. Bertozzi și aplicată ca ligatură Staudinger bioortogonală pentru marcarea unei game largi de biomolecule atât în celulele vii, cât și în organisme întregi [18] .
În același timp, a început să se dezvolte chimia click - un concept chimic care descrie prepararea bibliotecilor de compuși organici folosind reacții rapide și fiabile care permit asamblarea moleculelor din blocuri de construcție mici [19] . Dintre câteva reacții care satisfac acest concept, cicloadiția azidă-alchină catalizată cu cupru a găsit cea mai largă aplicație pentru modificarea in vitro a biomoleculelor [20] . Cu toate acestea, din cauza toxicității catalizatorului de cupru, o astfel de reacție nu a putut fi utilizată în celulele sau organisme vii. Grupul lui C. Bertozzi a creat o variantă non-catalitică a acestei reacții, cunoscută sub denumirea de cicloadiție azidă-alchină facilitată de stres (SPAAC), care este o reacție bioortogonală promițătoare [8] .
În prezent, continuă căutarea de noi reacții bioortogonale pentru a putea efectua modificarea paralelă a substraturilor în același sistem biologic.
În cazul ideal, reacția bioortogonală ar trebui să îndeplinească următoarele condiții particulare [3] [4] :
Această reacție a fost dezvoltată de grupul lui C. Bertozzi în 2000 pe baza reacției Staudinger clasice între azide și triarilfosfine [18] . Această reacție a devenit strămoșul domeniului chimiei bioortogonale, deoarece grupurile care reacţionează în ea (azide, fosfine) nu sunt prezente în biomolecule, dar acum nu este utilizată la fel de larg. Ligatura Staudinger a fost folosită pentru a modifica biomoleculele atât în celulele vii, cât și în șoareci [4] .
În reacția Staudinger, gruparea azidă acționează ca un electrofil moale , reacționând cu nucleofile moi , cum ar fi fosfinele . Majoritatea nucleofilelor biologice, în schimb, sunt nucleofile rigide care nu reacţionează cu azidele. În plus, legarea Staudinger are loc într-un mediu apos cu formarea unui produs stabil [18] .
Fosfinele sunt absente în biomoleculele naturale [21] și nu restabilesc legăturile disulfurice .
Folosind exemplul medicamentelor ( azidotimidină ), azidele s-au dovedit a fi biocompatibile . Dimensiunea mică a grupului azidic face ușoară introducerea în biomolecule prin căi metabolice [8] .
Baza reacției Staudinger este atacul nucleofil al fosfinei asupra atomului de azot terminal al grupării azide pentru a forma fosfazida 1 . Apoi, fosfazida 1 este transformată în iminofosforan 3 , însoțită de eliberare de azot, după care are loc hidroliza iminofosforanului cu formarea de amine și oxid de fosfină. Pentru aplicații în domeniul bioconjugării , reacția a fost modificată prin introducerea unei grupări ester în poziția orto a unuia dintre substituenții arii fosfinei. Ca urmare a atacului iminofosforanului 3 rezultat asupra acestei grupe, se formează un produs biciclic 4 , a cărui hidroliză conduce la formarea unei legături amidice stabile între substrat și marcajul introdus. Etapa limitatoare de viteză a reacției este atacul grupării azide de către molecula de fosfină [22] .
Principalul dezavantaj al acestei reacții este că fosfinele sunt lent oxidate de oxigen în sistemele vii. În plus, sunt probabil metabolizați de citocromii P450 [4] . Ligarea conform lui Staudinger decurge destul de lent, conform cineticii de ordinul doi, cu o constantă de viteză de aproximativ 0,0020 M −1 s −1 [4] . Încercările de a accelera atacul nucleofil prin introducerea de grupări donatoare de electroni în substituenții arii accelerează reacția, dar crește și viteza de oxidare a fosfinei.
Viteza de reacție lentă necesită o creștere a concentrației de fosfină utilizată, ceea ce crește semnalul de fundal produs de excesul de etichetă. S-au făcut eforturi pentru a depăși această problemă: au fost sintetizate fosfine fluorogene pe bază de fluoresceină [23] și cumarină [24] , a căror acțiune se bazează pe acumularea fluorescenței numai după încorporarea în biomoleculă, ceea ce a făcut posibilă obținerea unui salt mai mare în intensitatea radiației ca urmare a reacției. În prezent, cinetica reacției rămâne un obstacol serios în calea utilizării pe scară largă a acesteia.
Cicloadiția azidă-alchine fără cupru este o reacție bioortogonală dezvoltată de C. Bertozzi ca o versiune activată a reacției Huisgen . Spre deosebire de cicloadiția azidă-alchină catalizată cu cupru ( CuAAC , cicloadiția azidă-alchină catalizată cu Cu), această variantă a reacției se desfășoară cu o viteză mai mare datorită eliminării stresului unghiular din molecula de ciclootină în timpul formării produsului de adiție. Prin urmare, această reacție a devenit cunoscută sub numele de cicloadiție azidă-alchină promovată de tulpină ( SPAC ). Această modificare face posibilă evitarea utilizării unui catalizator toxic de cupru și utilizarea unei reacții fără cupru în celulele și organismele vii.
Cicloadiția clasică de azidă-alchine catalizată cu cupru este o reacție de bioconjugare foarte rapidă și eficientă , cu toate acestea, nu poate fi utilizată în celulele vii din cauza toxicității ionilor de Cu + . Toxicitatea este atribuită formării de specii reactive de oxigen generate de catalizatorii de cupru.
Liganzii au fost optimizați pentru a preveni efectele dăunătoare asupra biomoleculelor, cu toate acestea, s-a demonstrat că diferitele medii de liganzi din complexe afectează și metabolismul, deoarece introduc modificări nedorite în procesele celulare [25] .
Gruparea azidă este bioortogonală, deoarece este destul de mică (are puțin efect asupra pătrunderii moleculei în celulă), stabilă metabolic și nu apare în biomoleculele native. Deși azidele nu sunt cei mai reactivi compuși în adiție 1,3-dipolară, ele sunt preferate datorită absenței reacțiilor secundare în condițiile de modificare [26] . Fragmentul ciclooctin este mai mare, dar are ortogonalitatea și stabilitatea necesare pentru modificarea in vivo . Ciclooctinele sunt cele mai mici alchine ciclice stabile . Tensiunea unghiulară calculată în ciclurile lor este de 19,9 kcal/mol [27] .
Reacția se desfășoară ca o cicloadiție standard 1,3-dipolară cu o deplasare de electroni periciclică potrivită. Natura ambivalentă a 1,3-dipolului face imposibilă determinarea centrului electrofil și nucleofil în azidă, astfel încât imaginea direcției de tranziție a electronilor este lipsită de sens. Totuși, calculele arată că atomul de azot intern poartă cea mai mare sarcină negativă [28] .
Cicloadiția azidă-alchine fără cupru a fost adaptată pentru a utiliza nitrone în loc de azide . În acest caz, izoxazolinele N -substituite se formează ca produși de reacție . Viteza de reacție crește într-un mediu apos și se supune cineticii de ordinul doi cu o constantă de la 12 la 32 M – 1 s– 1 , în funcție de substituenții din nitronă. În ciuda vitezei mari a reacției, dezavantajul acesteia este dificultatea de a introduce nitrona în biomoleculă prin marcare metabolică. Reacția a fost utilizată pentru modificarea peptidei model și pegilarea proteinelor [9] .
În 2009, a fost dezvoltată o reacție de cicloadiție dipolară a oxizilor de nitril la norbornen . În special, a fost aplicat modificării postsintetice a oligonucleotidelor . Norbornene a fost ales ca dipolarofil datorită echilibrului dintre reactivitatea promovată de stres și stabilitate. Dezavantajele acestei reacții sunt electrofilitatea ridicată a oxidului de nitril, care duce la reacții secundare, precum și viteza de reacție scăzută [29] .
Reacția de cicloadiție a oxanorbornadienei cu azide are loc cu eliminarea ulterioară a furanului prin reacția retro-Diels-Alder. Tulpina inelului și epuizarea electronilor oxanorbornadienei cresc reactivitatea acesteia în etapa limitativă a cicloadiției. Scindarea furanului are loc rapid cu formarea de 1,2,3- triazol stabil [30] . Studiile preliminare au arătat utilitatea acestei reacții în modificarea peptidelor și a fost, de asemenea, utilizată în crearea de compuși imagistici în SPECT [31] .
Cicloadiția de s - tetrazine și ( E )-ciclooctene are loc ca o reacție Diels-Alder , urmată de o reacție retro-Diels-Alder cu eliberare de azot. Reacția se desfășoară foarte rapid cu o constantă de viteză de ordinul doi de 2000 M – 1 s– 1 (9:1 în sistemul metanol – apă ), ceea ce face posibilă modificarea biomoleculelor la concentrații foarte scăzute.
Calculul a arătat că energia de stres în ( Z )-ciclooctene este de 7,0 kcal/mol, ceea ce este mai mică decât în ciclooctan (12,4 kcal/mol), datorită pierderii a două interacțiuni transanulare. Dimpotrivă, configurația ( E ) a dublei legături crește foarte mult stresul inelului (17,9 kcal/mol), ceea ce are un efect pozitiv asupra vitezei de reacție [32] . Ca dienofil, se utilizează 3,6-diarils - tetrazina, care conține substituenți pentru a suprima interacțiunea cu apa. Eliberarea de azot în a doua etapă face reacția ireversibilă [33] .
S-a descoperit că apa accelerează reacția tetrazinelor cu ciclooctenele. Norbornenele au fost, de asemenea, folosite ca dienofile, dar reacția a decurs mult mai lent (1 M – 1 s– 1 în mediu apos). Reacția tetrazinelor cu ( E )-ciclooctenă a fost folosită pentru a marca celulele vii cu o etichetă fluorescentă [34] și pentru a combina polimeri [35] .
Reacția de clic a izonitrililor este o [4+1]-cicloadiție urmată de o reacție retro-Diels-Alder pentru a elibera N2 [ 12 . Din acest motiv, reacția este ireversibilă. Produsul este stabil dacă se utilizează izonitril terțiar. În cazul izonitrililor primari și secundari, se formează o imină, care este apoi rapid hidrolizată (prezentată cu roșu în diagramă).
Isonitrilul este un grup bioortogonal bun datorită dimensiunii sale mici, stabilității, non-toxicității și absenței din sistemele biologice. Cu toate acestea, reacția de [4+1]-cicloadiție decurge lent cu o constantă de viteză de ordinul doi de 10–2 M – 1 s– 1 .
Tetrazolul poate suferi o reacție de cicloeliminare fotoindusă cu eliberare de azot. În acest caz, se formează un 1,3- dipol de scurtă durată , care intră într-o cicloadiție 1,3-dipolară cu alchene , conducând la aducti de pirazolină [36] .
Fotoinducția are loc cu expunerea pe termen scurt la lumină (lungimea de undă depinde de tetrazol). Timpul de expunere este selectat astfel încât să reducă daunele cauzate de lumină celulelor. Reacția se accelerează într-un mediu apos și dă un singur regioizomer . Avantajele acestei abordări constau în posibilitatea controlului spațial și temporal asupra reacției. Utilizarea reacției este simplificată și de faptul că alchene sau tetrazoli pot fi introduși în biomolecule folosind metode biologice simple. În plus, a fost creat un tetrazol fluorogen, care face posibilă monitorizarea în timp a gradului de reacție [37] .
În timpul ligării cvadriciclanului, cvadriciclanul tensionat intră în [2+2+2]-cicloadiție cu sistemele π. Quadriciclanul nu apare în biomoleculele native, nu reacționează cu acestea (datorită saturației moleculei), are o dimensiune relativ mică și o tensiune puternică (≈ 80 kcal/mol). Cu toate acestea, este foarte stabil la temperatura camerei și în medii acvatice la pH fiziologic. Este capabil să reacționeze selectiv cu sistemele π cu deficit de electroni, dar nu și cu alchene simple , alchine sau ciclooctine [13] .
Bis(ditiobenzil)nichel(II) a fost selectat ca al doilea reactiv ca rezultat al screening -ului pentru reactivitate. Pentru a preveni inversarea fotoindusă la norbornadienă, la reacție se adaugă dietilditiocarbamat , care chelează nichelul din produsul rezultat. Reacția se desfășoară cu o constantă de viteză de ordinul doi de 0,25 M -1 s -1 (în mediu apos).
Cu utilizarea acestei reacții, precum și a cicloadiției azidă-alchine fără cupru și a reacției de formare a oximei , a fost creată o metodă pentru marcarea simultană a trei substraturi fără interferența reciprocă a acestor trei reacții [13] .
Mai multe reacții bioortogonale, în principal ligatura Staudinger și cicloadiția azidă-alchină fără cupru, sunt utilizate pe scară largă în domeniile bioconjugării și biologiei chimice .
Sistemele celulare de sinteză a proteinelor, precum și enzimele, pot introduce aminoacizi nenaturali în structurile proteice, confundându-le cu cele naturale. În special, s-a constatat că înlocuirea metioninei în mediul nutritiv al bacteriilor cu homopropargilglicină ( Hpg ) sau azidohomoalanină ( Aha ) a făcut posibilă integrarea acestor aminoacizi sintetici în proteinele sintetizate de celulă. Astfel de proteine conțineau grupări funcționale bioortogonale, azidă sau alchină, iar introducerea de biotină și coloranți fluorescenți echipați cu o grupare funcțională complementară (fosfină, ciclooctilă sau azidă) în celulă a făcut posibilă etichetarea și studierea selectivă a acestor proteine. În plus, azidohomoalanina și homopropargilglicina au fost folosite simultan pentru a modifica două tipuri diferite de proteine în paralel [38] .
Chimia bioortogonală a găsit, de asemenea, aplicație în profilarea activității proteinelor care au afinitate pentru un anumit ligand . Pentru a face acest lucru, ligandul este marcat cu o grupare funcțională bioortogonală și introdus în celulă. După ce a avut loc legarea proteinelor la ligand, celula este distrusă și totalitatea tuturor proteinelor este introdusă în reacție cu o etichetă care conține o grupare reactivă complementară. În acest caz, eticheta este introdusă numai în ligand și face posibilă distingerea și izolarea doar a acelor proteine care sunt asociate cu acest ligand [39] .
Glicanii nu sunt codificați direct genetic și nu au activitate specifică a proteinelor; prin urmare, metodele de etichetare genetică sau de afinitate nu sunt aplicabile acestora. Cu toate acestea, glicanii pot fi modificați metabolic cu carbohidrați sintetici modificați ( acid sialic , N -acetilgalactozamină, N -acetilglucozamină etc.) care conțin grupări azide. Glicanii cu grupări de azidă încorporate au fost introduși în legarea Staudinger cu un reactiv de biotină și studiati prin citometrie în flux [18] .