Secretomica este o secțiune de proteomică care studiază toate proteinele secretate ale unei celule , țesuturi sau organism [1] . Proteinele secretate nu sunt doar implicate în multe procese fiziologice diferite, inclusiv transducția semnalului celular și remodelarea matricei extracelulare , dar sunt, de asemenea, o parte integrantă a invaziei și metastazării celulelor maligne [2] . Secretomica este astfel importantă în identificarea biomarkerilor cancerului .
În 2000, Tjalsma și colab. au inventat termenul secreto în munca lor asupra bacteriei Bacillus subtilis . Secretomul a fost definit ca totalitatea tuturor proteinelor secretate și a aparatului secretor al unei bacterii. Folosind o bază de date cu secvențe de proteine de la B. subtilis și un algoritm care verifică locurile de hidroliză caracteristice proteinelor secretate și peptidelor semnal N-terminale , ei au reușit să prezică cât de mult din proteom este secretat de celulă [3] . În 2001, același laborator a stabilit standardul pentru secretomică: predicțiile bazate pe o singură secvență de aminoacizi nu sunt suficiente pentru a defini un secretom. Ei au folosit electroforeza 2D și spectrometria de masă pentru a identifica 82 de proteine secretate de B. subtilis , dintre care doar 48 au fost prezise pe baza secvenței de aminoacizi prin metoda descrisă în munca lor anterioară [4] .
Înțelegerea faptului că există multe căi de secreție netradiționale și că multe proteine nesecretate fac parte din calea secretorie tradițională a creat necesitatea unei definiții mai profunde a secretomului. În 2010, Agrawal și colegii au propus să definească un secret ca „un grup global de proteine secretate în spațiul extracelular de către o celulă, un țesut, un organ sau un organism la un moment arbitrar în timp și în condiții arbitrare prin mecanisme secretoare cunoscute și necunoscute. inclusiv organele secretoare nereglementate și reglate » [5] .
Text original (engleză)[ arataascunde] propunem o definiție revizuită a secretomului ca „grupul global de proteine secretate în ECS de către o celulă, un țesut, un organ sau un organism în orice moment și condiții date prin mecanisme secretoare cunoscute și necunoscute care implică organele secretoare constitutive și reglate”.Impuritățile sunt întotdeauna prezente în cultura celulară . Serul bovin din mediul de cultură și resturile celulare contaminează un set de proteine secretate care sunt utilizate pentru analiză. Componentele contaminante ale serului de bovine sunt deosebit de îngrijorătoare, deoarece multe dintre ele au secvențe de proteine similare cu cele umane (de exemplu, fibronectina și fibulina-1 ) [1] . Pentru a elimina contaminanții, celulele trebuie spălate cu tampon fosfat de sodiu (PBS) sau mediu fără ser (SFM) înainte de incubare în SFM și colectarea proteinelor secretate. Toate manipulările pentru eliberarea proteinelor intracelulare trebuie efectuate cu atenție pentru a evita deteriorarea celulelor [1] . În plus, timpul și condițiile de incubație pot fi optimizate astfel încât stresul metabolic cauzat de lipsa nutrienților din mediul de cultură să nu afecteze analiza secretomului [6] .
Unele proteine sunt produse în concentrații scăzute și apoi diluate în medii de cultură sau fluide corporale. Astfel de proteine sunt greu de detectat. Tehnicile de detectare a cantităților mici, cum ar fi precipitarea proteinelor cu acid tricloracetic , pot fi utilizate împreună cu metode extrem de sensibile, cum ar fi utilizarea de microarrays de anticorpi , care pot detecta chiar și molecule de proteine unice [7] .
Multe studii de secretom sunt efectuate in vitro folosind tehnici de cultură celulară. Dar rămâne neclar dacă aceleași proteine sunt secretate în condiții in vivo . Un număr tot mai mare de studii, în special cele care analizează secretoamele tumorale, folosesc metode in vivo pentru a confirma consistența rezultatelor obținute în laborator. De exemplu, fluidele corporale proximale din apropierea tumorii sunt colectate pentru analiza secretomului [1] .
Multe proteine secretate au o secvență peptidică N-terminală care este responsabilă de translocarea proteinei traduse în reticulul endoplasmatic (ER) . Procesarea proteinelor are loc în ER , care va duce în cele din urmă la secreție. Prezența acestor peptide semnal poate fi utilizată pentru a prezice secretomul celulei. Programe precum SignalP pot identifica secvențele semnal (și locurile lor de hidroliză) pentru a prezice proteinele care urmează să fie secretate. Deoarece proteinele transmembranare sunt , de asemenea, procesate în ER, dar nu sunt secretate, programe precum serverul TMHMM sunt utilizate pentru a prezice domeniile transmembranare și, astfel, pentru a elimina fals pozitive . Unele proteine secretate nu au secvențe clasice de peptide semnal. Aceste proteine care nu au un lider secretor N-terminal vor fi ratate de SignalP. SecretomeP este un program care a fost conceput special pentru a încerca să prezică proteinele secretoare non-clasice din secvențele lor [5] . Au fost prezise secretomi la nivel de genom pentru o gamă largă de organisme, inclusiv oameni , șoareci , pești zebra și sute de bacterii [5] .
Metodele de predicție a întregului genom au multe probleme. Există o mare probabilitate de rezultate fals pozitive și fals negative. În plus, expresia genelor este foarte dependentă de condițiile de mediu, ceea ce înseamnă că secretomul prezis din bibliotecile genomice sau ADNc este puțin probabil să coincidă complet cu secretomul adevărat. Pentru a confirma datele astfel obținute sunt necesare abordări proteomice [5] .
Mai multe baze de cunoștințe și secretom la nivelul genomului sunt disponibile pe baza predicțiilor computerizate și a curației. Aceste baze de date includ: Baza de date privind secretomul fungic (FSD), Baza de cunoștințe privind secretomul fungic (FunSecKB), Baza de cunoștințe privind secretomul fungic și proteomul intracelular (FunSecKB2), Baza de cunoștințe privind secretomul vegetal și proteomul intracelular ( PlantSecKB ) și Bacteria de acid lactic. Baza de date Secretome . Baza de date pentru secretom și proteom intracelular de metazoare (MetazSecKB) și baza de date pentru secretom și proteome intracelular de protist (ProtSecKB) au fost lansate recent . Deși există unele inexactități în predicțiile computerizate, aceste baze de date oferă resurse utile pentru caracterizarea în continuare a locației proteinelor într-o celulă.
Analiza spectrometrică de masă este o parte integrantă a secretomicei. Serul sau supernatantul care conține proteinele secretate este digerat de o protează , iar proteinele sunt separate prin tehnici bidimensionale de electroforeză în gel sau cromatografie . Fiecare proteină individuală este apoi analizată prin spectrometrie de masă, iar spectrul de masă peptidic rezultat poate fi vizualizat într-o bază de date pentru a identifica proteina [1] .
Folosirea metodei de etichetare a izotopilor neradioactivi pe bază de aminoacizi (SILAC) în cultura celulară poate ajuta la distingerea între proteina secretată și impuritățile din serul bovin din cultura celulară. Supernatantul din celulele crescute în medii normale și celulele din medii marcate cu aminoacizi sunt amestecate într-un raport unu la unu și apoi analizate prin spectrometrie de masă . Contaminanții proteici din ser vor prezenta un singur vârf deoarece nu au un echivalent marcat [1] . Un exemplu este utilizarea cu succes a SILAC pentru a face distincția între proteinele secretate de condrocitele umane și impuritățile din ser [8] .
Recent, utilizarea micromatricelor de anticorpi, o metodă de detectare a proteinelor extrem de sensibilă și de mare capacitate, a devenit parte a analizei secretomului. Anticorpii sau alte molecule de liant sunt fixați pe un suport solid. După aceea, se adaugă un amestec de proteine marcate fluorescent . Intensitatea semnalului este utilizată pentru identificarea proteinelor. Micromatricele de anticorpi sunt extrem de versatile: pot fi folosite pentru a analiza cantitatea de proteine dintr-un amestec, pentru a analiza alte izoforme de proteine , modificări post-translaționale și pentru a analiza activitatea biochimică a proteinelor. În plus, aceste micromatrice sunt foarte sensibile: pot detecta molecule de proteine individuale. Micromatricele de anticorpi sunt utilizate în prezent mai mult pentru analiza probelor de plasmă umană , dar pot fi utilizate și pentru celulele cultivate și analiza secretomului fluidelor biologice , oferind o modalitate simplă de a detecta simultan mai multe proteine [7] .
Pe lângă rolul lor important în procesele fiziologice normale, proteinele secretate joacă, de asemenea, un rol important în carcinogeneză , fiind implicate în creșterea celulelor, migrarea și invazia și angiogeneză . Aceste aspecte fac din secrtomia o metodă excelentă de depistare a biomarkerilor de cancer [9] . Utilizarea metodei proteomice pentru detectarea biomarkerilor de cancer în fluide biologice sau ser poate fi foarte complicată de faptul că fluidele corporale sunt foarte complexe și eterogene. Analiza secretomului liniilor celulare canceroase în țesuturile bolnave reprezintă o alternativă mai simplă și mai precisă pentru detectarea biomarkerilor [6] .
Pentru analiza secretomului cancerului, se folosesc două tipuri principale de materiale: supernatante ale liniilor celulare canceroase și fluide biologice (proximale și fluide în contact cu tumora ). Supernatantul liniilor de celule canceroase este sursa preferată de proteine secretate. Există multe linii de cultură disponibile și este mai ușor de analizat supernatantul decât lichidul corporal proximal. Dar rămâne neclar dacă secretul liniei celulare este o bună reprezentare a tumorii reale în micromediul său specific. În plus, liniile celulare cultivate nu arată eterogenitatea unei tumori reale [9] . Analiza fluidului proximal poate oferi o mai bună înțelegere a secretomului tumoral al unei persoane, dar această metodă are și dezavantajele ei. Procedurile de colectare a lichidului proximal ar trebui să fie standardizate și trebuie să fie necesare controale benigne. În plus, diferențele dobândite și genetice între pacienți pot complica analiza [9] .
Analiza secretomului a dezvăluit noi biomarkeri potențiali pentru multe tipuri de cancer, inclusiv cancerul pulmonar , cancerul hepatic , cancerul pancreatic , cancerul colorectal , cancerul de prostată și cancerul de sân . Antigenul specific de prostată (PSA) , biomarkerul standard actual pentru cancerul de prostată , are specificitate diagnostică scăzută: nivelurile de PSA nu se pot distinge întotdeauna între cancerele maligne și cele benigne, așa că este necesar un biomarker mai specific. Utilizarea analizei secretomului liniilor celulare de prostată într-un studiu a relevat mai multe proteine prezente în cantități mai mari în serul bolnavilor de cancer decât la persoanele sănătoase [6] .
De asemenea, există o mare nevoie de biomarkeri pentru a detecta cancerul de sân: în prezent, există doar biomarkeri pentru monitorizarea stadiilor avansate ale acestui tip de cancer [2] . Analiza secretomului liniilor celulare de cancer de sân a condus la descoperirea proteinei de activare a aderenței celulelor leucocitelor (ALCAM) , un nou biomarker cu potențial de diagnostic promițător [6] .
Analiza secretomilor embrionari umani poate fi utilă în căutarea unor metode neinvazive pentru determinarea viabilității embrionilor . FIV evalueaza dupa criterii morfologice pentru a gasi embrioni cu potential mare de implantare . Căutarea folosind o metodă cantitativă de evaluare poate ajuta la reducerea numărului de embrioni utilizați în FIV, reducând astfel probabilitatea unei sarcini multiple . De exemplu, într-un studiu, obțineți amprente secrete pentru multe blastociste și găsiți 9 proteine care pot diferi între blastocisti cu numere de cromozomi normale și anormale . Această metodă va înlocui diagnosticul genetic preimplantare (PGD) , care implică biopsia celulelor embrionare și poate fi dăunătoare dezvoltării fătului [10] .