Diagnosticul genetic preimplantare (DGP) este diagnosticul bolilor genetice la un embrion uman înainte de implantarea în mucoasa uterină, adică înainte de sarcină. De obicei, pentru analiză, se efectuează o biopsie a unui blastomer într-un embrion în stadiul de zdrobire (4-10 blastomere). În cazul purtării materne a unei patologii genetice, este posibilă o biopsie a primului și al doilea corp polar al ovulului înainte de fertilizare. În ultimii ani, a existat o tendință de trecere la o biopsie a trofectodermului (stratul exterior de celule) în stadiul de blastocist (a cincea zi de dezvoltare a embrionului) [1] . Diagnosticul genetic preimplantare este considerat o alternativă la diagnosticul prenatal . Principalul său avantaj este că atunci când îl utilizați, nu există întrerupere selectivă a sarcinii, iar probabilitatea de a avea un copil fără o boală genetică diagnosticată este destul de mare. Astfel, PGD este o procedură suplimentară față de tehnologiile de reproducere asistată și necesită fertilizare in vitro (FIV) . ( Cuprins în limba engleză )
Ideea diagnosticului genetic preimplantare a apărut chiar înainte de nașterea primului copil FIV. În 1967, a fost publicat un articol de R. Edwards ( RG Edwards ) și R. Gardner ( RL Gardner ) despre biopsia embrionilor de iepure pentru a determina sexul înainte de implantare, în care autorii au prezis apariția unor tehnologii similare la om [2] . Cu toate acestea, diagnosticul genetic preimplantare la om a devenit posibil abia la începutul anilor 90, când a fost atins un nivel tehnologic suficient de fertilizare in vitro și a fost dezvoltată reacția în lanț a polimerazei , care permite analiza ADN-ului în celule individuale.
În 1989, prima încercare reușită de a determina sexul a fost făcută folosind analiza PCR a unui blastomer prelevat de la un embrion în stadiul de clivaj (6-8 blastomere) [3] . Prima naștere reușită după o procedură similară la cuplurile cu risc de boală recesivă legată de X a avut loc în 1990 [4] .
În 1990, înainte de fertilizare a fost diagnosticată o boală monogenă, tehnica incluzând analiza PCR a corpurilor polari ai oului [5] .
Prima naștere a unui copil după diagnosticul PCR preimplantare al unei boli monogenice ( fibroza chistică ) a avut loc în 1992 [6] .
Ulterior, pentru a determina sexul embrionului, precum și anomaliile cromozomiale, a început să fie utilizată metoda de hibridizare fluorescentă in situ (FISH). Din 2012, metoda FISH pentru detectarea anomaliilor cromozomiale a fost înlocuită treptat de hibridizarea genomică comparativă. Metoda PCR a rămas indispensabilă pentru diagnosticarea bolilor monogenice.
Diagnosticul genetic preimplantare (DGP) este indicat pentru cuplurile care sunt purtători ai unei rearanjamente cromozomiale sau boli monogenice. Exemple de boli monogenice sunt fibroza chistică , boala Tay-Sachs , anemia falciformă , hemofilia A, miodistrofia Duchenne și multe altele.
În plus, PGD se efectuează în cupluri cu risc crescut de anomalii congenitale la copii, care nu este asociat cu purtarea mutațiilor diagnosticate. Astfel de cazuri includ cuplurile la care vârsta mamei este peste 35 de ani; în cazul în care vârsta tatălui este peste 39 de ani; dacă tatăl are tulburări severe de spermatogeneză; în cuplurile cu avort spontan; în cuplurile cu încercări repetate de FIV fără succes.
În cazul unui risc crescut nedeterminat de a avea un copil cu anomalii congenitale, PGD se efectuează pentru nouă cromozomi, care sunt asociați cu cele mai frecvente boli congenitale. Acestea sunt cromozomul 13 ( sindromul Patau ), cromozomul 15 ( sindromul Prader-Willi ), cromozomul 16, cromozomul 17, cromozomul 18 ( sindromul Edwards ), cromozomul 21 ( sindromul Down ), cromozomul 22 ( sindromul pupilei de pisică ), precum și sexul . cromozomii X și Y (diverse anomalii numerice, inclusiv sindromul Shereshevsky-Turner și sindromul Klinefelter ).
PGD se efectuează în unele cazuri, fără legătură cu o posibilă patologie genetică a fătului, scopul unui astfel de diagnostic este nașterea unui copil cu anumite caracteristici genetice. Astfel de cazuri includ, de exemplu, PGD, efectuat pentru a preveni conflictul Rhesus .
Există cazuri când PGD este efectuat pe una sau mai multe celule prelevate dintr-o biopsie de la embrioni preimplantați pentru a testa compatibilitatea pentru antigenele leucocitare umane (HLA). Scopul procedurii este de a iniția o sarcină în care fătul este compatibil HLA cu un frate afectat care are nevoie de un transplant de celule stem hematopoietice. [7] [8] Un astfel de exemplu este cazul când un donator compatibil cu HLA sa născut folosind PGD pentru terapia celulară a anemiei Fanconi într-un proband [9] . În acest caz, anemia Fanconi a fost exclusă și a fost selectat tipul necesar de histocompatibilitate . În Rusia, a fost descris un caz clinic al unei fete de 6,9 ani cu insuficiență medulară, pentru tratamentul căruia s-a născut un donator sănătos identic cu HLA. Tratamentul a fost de succes pentru primitor și nedureros pentru donator. [zece]
Diagnosticul preimplantare este posibil numai în cadrul ciclului de tratament FIV .
Spre deosebire de FIV convențională, în care se adaugă un număr mare de spermatozoizi în ovul, înainte de diagnosticul preimplantare, fertilizarea se realizează folosind injecția intraplasmatică a spermatozoizilor ( ICSI ), adică spermatozoizii sunt injectați în ovul „manual” folosind instrumente microchirurgicale. Procedura ICSI este necesară datorită faptului că la colectarea corpurilor polari sau a blastomerilor, există riscul ca materialul genetic al unui spermatozoid care nu a participat la fertilizare să intre în analiză împreună cu celula embrionară.
Pregătirea pentru ciclul de tratament și ciclul de tratament FIV cu PGD în sine nu diferă practic de ciclul obișnuit de tratament FIV:
Dacă o tulburare genetică este moștenită de la o femeie, atunci embrionii „sănătoși” pot fi selectați testând numai corpurile polare, fără a atinge embrionul însuși. De asemenea, este posibil să testați numai blastomere. Sau un studiu secvenţial al corpurilor polari, apoi se pot efectua blastomeri.
Ce schemă PGD va fi utilizată pentru fiecare caz specific este determinată în consultare cu un genetician sau un consultant PGD special instruit atunci când se planifică DGP.
În timpul primei diviziuni a meiozei, ovocitul de ordinul 1 se divide, rezultând formarea ovocitului de ordinul 2 și a unui mic prim corp de reducere (ambele celule cu un set haploid de cromozomi). În timpul celei de-a doua diviziuni a meiozei, ca urmare a diviziunii ovocitului de ordinul al 2-lea, se formează un ou și un al doilea corp de reducere. Primul corp de reducere se împarte uneori și în două celule mici identice. Ca urmare a acestor transformări ale ovocitului de ordinul I, se formează un ou și trei corpi reducători, unde atât ovulul, cât și corpurile reducătoare au un set haploid de cromozomi. Astfel, corpurile polare pot fi examinate pentru a determina dacă oul a moștenit un defect genetic.După fecundarea ovulelor de către spermatozoizi în condițiile laboratorului embriologic, embrionul se dezvoltă - celulele se divid. În a treia zi, embrionul este format din 6-8 blastomeri. Și în a treia zi, materialul biologic este luat pentru cercetare genetică - așa-numita „biopsie embrionară”, adică extragerea unui blastomer (și uneori și a corpurilor polari) din embrion cu ajutorul microinstrumentelor speciale. Procedura nu interferează cu dezvoltarea ulterioară a embrionului. În timp ce se efectuează diagnosticul genetic, embrionii continuă să se dezvolte într-un mediu de cultură adecvat până la transferul în cavitatea uterină în a 5-a zi de dezvoltare. Până în acest moment, embrionul ar fi trebuit să ajungă în stadiul de blastocist.
Înainte de transfer, embriologul evaluează structura și forma embrionilor. Rezultatul diagnosticului genetic este comparat cu morfologia embrionilor și se face o concluzie despre care embrioni sunt recomandați pentru transferul în uter. Pentru transfer sunt selectați embrionii cu cele mai bune caracteristici morfologice fără tulburări genetice.
Analiza se realizează într-un timp foarte scurt. Pentru analiza blastomerelor sunt disponibile doar 2 zile, întrucât embrionul nu își poate continua dezvoltarea în afara corpului mamei dincolo de stadiul de blastocist (a 5-a zi după fertilizare), deci studiul trebuie efectuat în acest timp scurt.
O abordare alternativă este efectuarea PGD într-un criociclu. În acest caz, se efectuează o biopsie în a 5-a zi de dezvoltare, iar imediat după aceasta, embrionii sunt supuși crioconservarii . În luna următoare, se realizează diagnosticul genetic și embrionii recomandati fără mutații sunt transferați în uter în timpul următorului ciclu. Practicarea unui ciclu deconectat are o serie de avantaje: risc mai mic de hiperstimulare , mai mult material și timp pentru analiză, procedură de biopsie mai puțin traumatică pentru embrion. Dezavantajul criociclului este timpul mai lung de la începutul stimulării până la transferul embrionului [1] .
Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este o metodă de analiză citogenetică utilizată pentru a identifica și localiza secvențe specifice de ADN pe cromozomii de metafază și în nucleele interfazice . Această metodă utilizează sonde ADN , care sunt o secvență de nucleotide de dimensiune limitată care este complementară unei regiuni specifice a ADN-ului nuclear. Sonda poartă o „etichetă”, adică conține nucleotide asociate cu un fluorofor (o moleculă capabilă de fluorescență). După procedura de hibridizare , în cazul formării unei molecule de sondă de ADN hibrid și a ADN-ului țintă pe preparatul citogenetic studiat, se poate observa strălucirea secvențelor specifice de ADN pe cromozomi sau în nuclee folosind un microscop fluorescent .
Reacția în lanț a polimerazei este o metodă bazată pe copierea selectivă multiplă a unei anumite regiuni ADN folosind enzime în condiții artificiale ( in vitro ). În acest caz, se copiază doar zona care îndeplinește condițiile specificate și numai dacă este prezentă în eșantionul studiat.
Capacitatea de a diagnostica înainte de sarcină este principalul avantaj al DGP. Un astfel de diagnostic minimizează riscul ca dezvoltarea fătului să fie întreruptă din motive genetice. În plus, mai mulți embrioni sunt obținuți de obicei în ciclul FIV-PGD, ceea ce face posibilă selectarea unui embrion fără o tulburare genetică. Dezavantajele DGP sunt necesitatea de a face un ciclu de tratament FIV și un cost destul de ridicat. Cu toate acestea, beneficiile PGD și experiența în diverse clinici din întreaga lume dovedesc eficacitatea acestei tehnologii. Astăzi, PGD oferă pacienților cu o patologie ereditară o modalitate alternativă de a reduce riscul de sarcină cu un făt bolnav și de nașterea unui copil cu o boală genetică. Trebuie avut în vedere faptul că PGD nu poate fi un înlocuitor complet al diagnosticului prenatal. Datorită severității patologiei ereditare, care este verificată în timpul PGD și diagnosticul prenatal, este necesar să se aplice toate metodele de cercetare și diagnostic de confirmare pentru a exclude un defect genetic.
Kuliev, A., Rechitsky, S. și Simpson, JL (2020). Teste genetice practice preimplantare. Arhivat pe 12 iulie 2020 la Wayback Machine Springer Nature. ISBN online 978-3-030-43157-0 Arhivat 12 iulie 2020 la Wayback Machine