Analiza imunofluorescentă ( MFA - metoda anticorpilor fluorescenți , imunofluorescență ) ( ing. Imunofluorescență ) - un set de metode imunologice pentru determinarea calitativă și cantitativă a antigenelor de suprafață și intracelulareîn probe de suspensii celulare (culturi celulare, bacterii, micoplasme, rickettsie, viruși), probe de sânge, măduvă osoasă, spălări alveolare, secțiuni de țesut subțire. Metoda face posibilă analizarea în detaliu a probelor biologice pentru prezența anumitor determinanți antigenici caracteristici anumitor agenți patogeni sau boli, pentru a cuantifica atât proteinele și receptorii de suprafață, cât și intracelulari. Examinarea și evaluarea pot fi efectuate manual utilizând un microscop fluorescent sau automate folosind un citometru de flux ( citometru de flux ) sau un citometru cu microcip (citometru cu cip ).). Este posibil să se utilizeze un microscop confocal și un microscop fluorescent robot (inclusiv cele combinate cu un citometru în flux) în combinație cu un sistem software de procesare a imaginii. Tehnologiile automate disponibile în prezent fac posibilă analiza a aproximativ 50 de antigene diferite într-o singură probă folosind un set de diferiți markeri fluorescenți în format microscopie și citometrie cu o mare informație (metodele se numesc imagistică cu conținut ridicat , citometrie cu conținut ridicat , citometrie cu conținut ridicat, screening ) și aproximativ jumătate din setul maxim de antigene folosind citometria în flux modernă sau microscopia confocală. Principalele aplicații practice sunt oncologia, microbiologia, biologia celulară, genetica, farmacologia etc.
Esența metodei constă în vizualizarea antigenului prin anticorpi specifici cu markeri fluorescenți. Metoda de conjugare a globulinelor cu fluorocromi organici a fost dezvoltată în 1942 de A. Koons. [1] În prezent, metoda utilizează atât anticorpi la diferiți antigeni, cât și colorări specifice pentru ADN (de exemplu, DAPI ), ARN (de exemplu, Sybr Green II ), lipide și proteine.
În tehnica de bază MFA, se face o distincție între metoda directă dezvoltată de A. Koons și Melvin Kaplan [2] și metoda indirectă dezvoltată de A. Koons și Wheeler în versiunea originală a MFA indirectă cu complement .
În metoda directă ( pMPA ), o soluție de anticorpi marcați direct cu un colorant fluorescent este aplicată preparatului de testat sau suspensiei celulare. Formarea unui complex antigen-anticorp este detectată printr-un semnal fluorescent sub forma unei străluciri de diferite grade de intensitate și claritate.
Cu metoda indirectă ( nMFA ), anticorpii împotriva antigenilor doriti (așa-numitii „primi” anticorpi) sunt aplicați preparatului, iar apoi „al doilea” anticorp specific speciei împotriva „primului” anticorpi, ceea ce evită reacțiile nespecifice. În acest caz, doar al doilea anticorp este conjugat cu un colorant fluorescent. De exemplu, dacă în studiu, anticorpii de șoarece, IgG de șoarece, sunt utilizați ca „primi” anticorpi, atunci IgG anti-specie anti-șoarece conjugați cu un colorant fluorescent sunt utilizați ca „al doilea”. Complexul antigen-anticorp produce colorare fluorescentă numai după legarea la un „al doilea” anticorp.
Metodele indirecte necesită doar seruri de specii de antiglobulină cu fluorocromi, dar necesită un număr mare de controale de testare. La setarea prin metoda directă, se face un singur control, deși în versiunile anterioare ale metodei erau necesare multe seruri monospecifice. Pentru o lungă perioadă de timp, dezavantajele tipurilor directe de MFA au fost sensibilitatea limitată din cauza prezenței unor posibile reacții încrucișate între obiecte similare în compoziția antigenică și fluorescența nespecifică datorită adsorbției globulinelor fluorescente pe diferite elemente ale medicamentului. Conjugate standard comerciale utilizate în prezent care conțin imunoglobuline la antigenele studiate. Utilizarea imunoglobulinelor bioinginerești și un grad ridicat de purificare a anticorpilor au făcut posibilă anularea practic a reacțiilor nespecifice, ceea ce a făcut posibilă dezvoltarea tehnologică ulterioară a metodei.
Deoarece metoda directă evită în prezent reacțiile nespecifice, metodele automate folosesc în mod predominant metoda directă de imunofluorescență.
Rezultatele unei evaluări microscopice manuale sunt descrise în așa-numitele „cruci” (de la unu + la patru ++++) - o gradare subiectivă a severității reacției de către ochiul cercetătorului. În metodele automate se folosesc ca detector fotomultiplicatoare sau camere fluorescente extrem de sensibile, care permite înregistrarea semnalului cu o precizie ridicată și dă valoarea nivelului relativ de fluorescență (raportul de fluorescență relativ) într-o gamă largă a scalei. Valoarea absolută este calculată utilizând controale sau antigeni cu un conținut constant cunoscut în probă. Atunci când se utilizează metode automate, prelucrarea datelor se realizează prin programe specializate pentru prelucrarea imaginilor și analiza datelor citometrice.
Metoda are o importanță decisivă în diagnosticarea precoce și tratamentul bolilor oncologice (imunohistochimie, oncohematologie), diagnosticarea bolilor infecțioase (de exemplu, determinarea celulelor CD4+ în HIV) și sindroame ereditare. Se dezvoltă intens metode automate, inclusiv domeniile imagistică cu conținut ridicat și citometrie cu conținut ridicat , metode combinate de citometrie-microscopie ( citometru-microscop ), care s-au dezvoltat în paralel din anii 90 , precum și metode de citometrie cu microcip cu holografie cu plasmon. [3] în care anticorpii individuali sunt marcați cu nanoparticule.
| Patologia în medicină | |
|---|---|
| patohistologie | Deteriorarea celulelor apoptoza Necrobioză cariopicnoza cariorexie carioliza Necroză necroza coagulativă necroza coluațională cangrenă sechestrare infarct Adaptarea celulară Atrofie Hipertrofie Hiperplazie Displazie Metaplazie scuamoase glandular Distrofie Proteină gras carbohidrați Mineral |
| Procese patologice tipice |
|
Diagnosticare de laborator și autopsie |
|