Riboswitch [1] ( eng. riboswitch ) este un element al regiunii 5’-netranslated (5’-UTR) a ARNm . Ea efectuează reglarea cis a ARNm pe care se află prin legarea de liganzi - o varietate de molecule mici , de exemplu, cobamamidă , tiamină pirofosfat , lizină , glicină , flavin mononucleotid , guanină , adenină și altele. Un riboswitch tipic include două domenii principale : un domeniu aptameric care recunoaște și se leagă de un ligand și o platformă de expresie care interacționează cu proteinele de transcripție sau de translație. Domeniul aptamer și platforma de expresie se suprapun în regiunea așa-numitei secvențe de comutare, care este responsabilă pentru plierea ARN-ului în două structuri secundare care se exclud reciproc , datorită cărora se realizează reglarea.
Riboswitch-urile au fost identificate în reprezentanții tuturor celor trei domenii de viață , precum și în unele viruși [2] [3] .
Multe bacterii pot fie transporta moleculele mici necesare din mediu, fie le pot sintetiza singure din precursori simpli. Fiecare dintre aceste procese necesită un set diferit de proteine , iar bacteriile folosesc adesea un mecanism de feedback pentru a controla produsele etapelor enzimatice anterioare: un exces de produs dorit fie inhibă propria sinteza, fie activează etapele enzimatice ulterioare. De obicei, nivelul metaboliților celulari este monitorizat de proteine speciale care interacționează cu ADN-ul sau ARN -ul , reglând sinteza enzimelor corespunzătoare. Din acest motiv, când a fost descoperită suprimarea genelor pentru biosinteza vitaminelor B 1 , B 2 și B 12 de către astfel de compuși precum tiamina , riboflavina și respectiv cobalamina , eforturile principale au fost îndreptate către căutarea proteinelor represoare adecvate care urmăriți nivelul acestor compuși. Cu toate acestea, nu au fost găsiți astfel de modulatori ipotetici. Aceste rezultate au atras atenția asupra posibilului rol reglator al secvențelor conservate de ARNm („cutii”) și au făcut sugestia îndrăzneață că este posibil ca nivelul acestor derivați de vitamine să fie monitorizat direct de ARN. În plus, în 1998, Grundy și Henkin [4] au arătat că regiunea lider de ARNm Salmonella typhimurium cob are conformații semnificativ diferite în prezența și absența adenozilcobalaminei (AdoCbl). Cu toate acestea, încercările de a testa direct legarea cobalaminei la ARNm nu au avut succes. Rezultate similare au fost obținute cu ARNm btuB de Escherichia coli : adăugarea de AdoCbl a determinat oprirea transcriptazei inverse în apropierea capătului 3’ al regiunii lider ARNm în timpul extensiei primerului in vitro , ceea ce, aparent, indică stabilizarea acestei regiuni la legarea de metabolit . [5] .
În cele din urmă, s-a demonstrat că trei derivați de vitamine, tiamină pirofosfat (TPP), flavin mononucleotid (FMN) și AdoCbl, s-au dovedit a interacționa direct cu ARNm-urile lor pentru a controla operonii de vitamina B1 , B2 și B12 . Aceste rapoarte au arătat că legarea metaboliților stabilizează conformația unui senzor de ARN conservat evolutiv (aptamer natural) și induce plierea regiunilor ARN din aval neconservate într-o structură care afectează terminarea transcripției sau inițierea translației . Astfel, legarea directă a metabolitului de ARN determină „riboswitch” ARNm între conformațiile alternative, afectând expresia genelor [5] . Termenul „riboswitch” a fost propus în 2002 de Breaker și colegii [4] .
De la descoperirea primelor riboswitch-uri specifice vitaminelor, au fost descoperite multe alte tipuri de riboswitch. Până în prezent, s-a stabilit că riboswitchurile pot răspunde la purine și derivații acestora, coenzime proteice și compuși înrudiți, aminoacizi și zaharuri fosforilate . Unele ribocomutatoare reacționează în mod specific la liganzi anorganici , inclusiv metale ( ioni Mg 2+ ) , care sunt atrași de coloana vertebrală zahăr-fosfat încărcată negativ a ARN și de anioni de fluor încărcați negativ [5] .
Funcțional și structural, două domenii pot fi distinse în riboswitch-uri. Primul dintre acestea, domeniul aptamer, este responsabil pentru legarea ligandului și formează un buzunar de legare a ligandului potrivit pentru un anumit ligand. Al doilea domeniu, cunoscut sub numele de platforma de expresie, conține un element de comutare a structurii secundare care interacționează cu proteinele reglatoare transcripționale și translaționale. Domeniul aptamer și platforma de expresie se suprapun în zona secvenței de comutare, care îndeplinește funcția de reglare. Secvența de comutare direcționează schimbarea a două structuri care se exclud reciproc ale platformei de expresie, care corespund stărilor „pornit” și „oprit” ale ARNm [2] .
În ciuda varietății uriașe de liganzi riboswitch, activitatea de reglare a marii majorități a riboswitch-urilor bacteriene are ca scop modificarea transcripției sau translației genelor responsabile de transportul și sinteza acestui metabolit. Această activitate de reglare se bazează pe faptul că, în funcție de prezența unui ligand, ARN-ul poate adopta două conformații care se exclud reciproc. În cazul transcripției, astfel de structuri acționează ca un terminator independent de Rho sau ca ac de păr anti-terminator . În cazul translației, rearanjamentele dependente de ligand includ împachetarea în exterior sau în interior a situsurilor de legare a ribozomului ( situs de legare a riozomului , RBS ) sau a secvenței Shine- Dalgarno ( SD ) . Studii recente au arătat că riboswitch-urile pot media terminarea transcripțională dependentă de Rho. Acest mecanism de reglare pare să fie larg răspândit, deoarece un număr de riboswitch-uri nu au terminatori Rho-independenți sau ac de păr care îndepărtează RBS sau SD în interiorul moleculei [5] .
Un mod neobișnuit de reglare utilizează ribozima ribozimă glmS , care asigură că ARNm este scindat după legarea de metabolit. Acest ARN necodant se găsește de obicei în bacteriile Gram-pozitive și interacționează cu glucozamină -6-fosfat (GlcN6P), care, după ce se leagă de ARNm glmS , îl taie la riboswitch. RNaza J degradează apoi clivajul începând de la capătul 5'-OH, prevenind astfel translatarea ARNm glmS . Riboswitch -ribozyme glmS rupe noțiunea tradițională conform căreia un riboswitch recunoaște un singur compus: acest riboswitch se poate lega la o serie de compuși înrudiți și, prin urmare, poate servi la evaluarea stării metabolice generale a unei celule [5] [4] .
Unele riboswitch-uri pot fi implicate în diferite procese de reglementare. Diguanosil-5'-monofosfat ciclic (c-di-GMP), un al doilea mesager , declanșează o serie de modificări fiziologice, iar riboswitch-urile corespunzătoare sunt situate lângă genele implicate în motilitatea celulară, virulența și alte procese. Unele riboswitch-uri care funcționează cu c-di-GMP sunt situate lângă intronii grupului I de auto-splicing . Acești regulatori ARN funcționează printr-o cascadă complexă de evenimente care necesită participarea ambelor regiuni de reglare ale ARN. c-di-GMP se leagă de aptamerul său și induce o schimbare a pliului care permite GTP să atace capătul 5' al intronului . Ca rezultat, intronul este excizat, iar regiunile RBS care sunt îndepărtate unele de altele se apropie una de cealaltă, formând ARNm capabil de translație. Această interacțiune alosterică combinată a celor două regiuni ARN are ca rezultat un sistem de control în două puncte care recunoaște concentrațiile atât de c-di-GMP, cât și de GTP și declanșează splicing. Această ipoteză necesită confirmare experimentală [5] .
După descoperirea riboswitch-urilor, s-a sugerat că aceste elemente de reglare cis tipice pot acționa și ca elemente de reglare trans . Acest lucru pare să fie adevărat cel puțin pentru riboswitchurile S-adenosilmetionină (SAM) SreA și SreB Listeria monocytogenes . După terminarea transcripției dependentă de SAM, aceste riboswitch-uri se leagă complementar de regiunea 5’-netradusă (5’-UTR) a ARNm care codifică factorul de virulență PrfA și suprimă expresia acestuia la nivel de translație [5] .
La eucariote, decuplarea transcripției și traducerii, precum și prezența intronilor, necesită participarea diferitelor mecanisme de reglare a expresiei genelor. Riboswitch-urile eucariote de tiamină pirofosfat (TPP) nu afectează transcripția și/sau translația, ci splicing-ul alternativ . Îmbinarea "normală" are loc atunci când un loc din cadrul unui riboswitch situat într-un situs intergenic sau 3'-UTR se asociază în mod complementar cu un situs care se întinde pe unul dintre situsurile de îmbinare. Acest lucru se întâmplă în absența TRR. Produsul obținut după splicing este tradus într-o proteină completă. Când TPP este prezent într-o celulă la o concentrație de prag, se leagă de riboswitch, determinând la suprafață un loc de îmbinare ascuns până acum și să devină accesibil aparatului de îmbinare. În funcție de specie, ARNm-ul îmbinat alternativ conține codoni de oprire interni care fie conduc la translatarea peptidei greșite ( ciuperci filamentoase ) fie la terminarea prematură a translației ( alge verzi ). La plantele superioare, splicing-ul alternativ are ca rezultat transcrieri cu 3'-UTR prea lungi, care le destabilizează [5] . Uneori, riboswitch-urile pot regla atât transcripția, cât și traducerea. Riboswitch-ul SAM-I răspunde la modificările concentrației de sulf cu formarea de ARN antisens , dar detaliile procesului de reglare sunt încă necunoscute [4] .
Deși riboswitchurile eucariote bine descrise se referă numai la sisteme dependente de TPP, un studiu recent a arătat prezența aptamerilor ARN care leagă adenozină în genomul vertebratelor . Rolul biologic al acestor ARN este încă în studiu. Unele ARNm eucariote pot răspunde la schimbările de mediu prin schimbarea de la una dintre conformațiile alternative la alta, similar cu riboswitch-urile. De exemplu, ca răspuns la semnalele de la interferon-y și hipoxie , apare o schimbare a ARN în ARNm 3'-UTR al factorului de creștere a endoteliului vascular -A (VEGF), care afectează translația VEGF în celulele mieloide . Cu toate acestea, modificarea conformației în acest caz este asociată nu cu metabolitul, ci cu legarea de proteine ca răspuns la un stimul extern [5] .
Riboswitch-urile nu funcționează întotdeauna ca unități de reglementare unice. Două domenii senzoriale sau ribocomutatoare întregi (în cazul așa-numitelor ribocomutatoare tandem) sunt uneori adiacente. De exemplu, multe riboswitch-uri de glicină constau din doi senzori de glicină separați printr-o inserție scurtă de legătură și pot lua o structură terțiară foarte complexă. Chiar dacă cele două domenii senzoriale se pot ajuta reciproc în plierea și legarea de un ligand, scopul biologic al unei astfel de duplicări nu a fost încă stabilit fără echivoc. Rolul biologic al riboswitch-urilor tandem cu diferite specificități este mai clar. Ele modulează expresia genelor numai atunci când toți metaboliții necesari sunt prezenți în celulă. Căile de reglare mediate de riboswitch-uri pot fi incluse în alte sisteme chiar mai complexe de reglare a expresiei genelor. De exemplu, riboswitchurile L. monocytogenes SAM funcționează numai la temperaturi permisive pentru infecție, când termometrul ARN adiacent își schimbă conformația și se topește. Un alt exemplu este utilizarea etanolaminei Enteroccus faecalis , în care riboswitch-ul AdoCbl acționează împreună cu o proteină reglatoare care afectează stabilitatea terminatorilor de transcripție [5] .
Selectivitatea excepțională a riboswitch-urilor se datorează în întregime conservatorismului domeniilor senzorilor lor. Locurile de recunoaștere a ligandului variază foarte mult în dimensiunea și complexitatea structurilor secundare și terțiare . Pentru toate clasele principale de riboswitches, precum și pentru unele subclase, s-au obținut structuri ale domeniilor senzoriale în combinație cu liganzii corespunzători, s-au obținut structuri cu rezoluție ridicată. Deși riboswitch-urile au conformații foarte diferite (numai riboswitch-urile cu purină strâns legate prezintă o oarecare similitudine), structura majorității riboswitch-urilor conține joncțiuni multi-helix și pseudonoduri asemănătoare ribozimei . Din acest motiv, majoritatea riboswitch-urilor pot fi împărțite în două tipuri în funcție de structură: primul tip include riboswitch-uri, a căror structură este reprezentată de conexiuni ale mai multor elice (riboswitches „de conectare”), iar al doilea tip include riboswitches cu pseudonoduri în structura [5] .
Riboswitch-urile de „conectare” pot fi împărțite în două subtipuri, în funcție de locația joncțiunii cheie în care este implicată helixul de reglare P1. Acesta acoperă domeniul senzorului și, de regulă, conține o regiune care îi permite să se conecteze la diferite elemente structurale. La riboswitch-urile de tip Ia, joncțiunea multihelidiană ocupă o poziție centrală și conectează elicele rămase cu elica P1, care, de regulă, participă la multe interacțiuni care stabilizează structura terțiară a moleculei. Acesta este ceea ce se întâmplă în purine și riboswitch-uri TPP. Unul dintre elice poate fi mult mai lung decât celelalte și este capabil să se îndoaie la conexiunea multihelical, unde formează interacțiuni terțiare; așa este aranjat riboswitch-ul de lizină - unul dintre cele mai mari riboswitch descrise [2] . Pungi de legare a metaboliților sunt formate în interiorul sau în apropierea joncțiunii multicoil, astfel încât legarea ARN la ligand afectează direct stabilitatea întregii joncțiuni multicoil și a helixului P1 [5] .
Riboswitch-urile de al doilea tip (Ib) sunt caracterizate prin arhitectura „inversă” a conexiunilor, în care conexiunea multihelical cheie este retrogradată la periferia moleculei și este situată departe de helixul P1. Helixul care emană din joncțiune se îndoaie spre P1 și îl stabilizează prin interacțiuni terțiare de lungă durată. Metaboliții se leagă de ARN la joncțiune și/sau lângă P1, afectând formarea acestuia prin stabilizarea conformației generale și a interacțiunilor terțiare. Reprezentanții tipici ai clasei Ib sunt tetrahidrofolatul (THF) și riboswitch-urile de magneziu [5] .
Subtipul II include riboswitch-uri precum SAM-II- și riboswitch-uri fluorură, ale căror structuri sunt reprezentate în întregime de pseudonoduri mici. Merită subliniat faptul că pseudonodurile sunt părți importante ale unor riboswitches „de conectare”, ele pot fi implicate în formarea pungilor de legare a metaboliților, ca în cazul riboswitch-ribozimei glmS , precum și în formarea de terțiari cu rază lungă. legături, ca în riboswitch-ul SAM-I [5] .
Devine clar că structura riboswitch-ului și ligandului nu sunt legate între ele. Mai mult, în cele trei clase de riboswitch care recunosc SAM, există diverse elemente structurale de legătură și pseudo-noduri. În plus față de spirale și pseudonoduri , elementele structurale adesea găsite în riboswitch-uri includ K-turns ( kink turn, K turn ), interacțiuni kissing-loop, bucle sarcină-ricină și bucle T [2] . Aceasta arată capacitatea uimitoare a ARN-ului de a asuma configurații diferite pentru a recunoaște același ligand. Este demn de remarcat faptul că multe riboswitch-uri conțin motive structurale repetitive care sunt prezente în alte ARN-uri naturale și artificiale. Ca și alți ARN funcționali, riboswitch-urile folosesc aceste motive ca blocuri de bază pentru a construi structuri spațiale complexe [5] .
Riboswitchurile sunt capabile să recunoască liganzi de o mare varietate de natură chimică și nu au nicio caracteristică comună care să le permită să se lege de metaboliți. Cu toate acestea, există o serie de caracteristici comune în legarea liganzilor de către riboswitch-uri. Majoritatea riboswitch-urilor formează buzunare rigide de legare care sunt potrivite în mod ideal pentru legarea porțiunilor din structurile de ligand recunoscute, iar liganzii mici se potrivesc complet în astfel de buzunare. Legarea ligandului provoacă modificări structurale în riboswitch-uri [2] . Pungile sunt de obicei înconjurate de nucleotide conservate și perechi de baze non-canonice dispuse într-o spirală neregulată extinsă sau elice convergente. Cu câteva excepții, majoritatea liganzilor folosesc heteroatomi pentru a forma legături specifice de hidrogen și interacțiuni electrostatice cu ARN. Adesea se formează legături specifice de hidrogen între capetele liganzilor și nucleotidele ARN nepotrivite conservate (de exemplu, G40 într-un senzor de aminopurină). Grupurile plane de liganzi, de regulă, participă la interacțiunile de stivuire și sunt intercalate între purinele ARN. Ionii metalici precum Mg2 + și K + pot compensa sarcina negativă a ligandului sau a grupărilor sale funcționale, cum ar fi reziduurile de fluor , carboxil și fosfat . Ionii metalici sunt, de asemenea, implicați în interacțiunile ligand-ARN prin coordonare directă sau mediată de apă. Toate aceste proprietăți au fost demonstrate în complexe de ribocomutatoare și liganzii lor corecti utilizând analiza de difracție cu raze X a riboswitch-urilor care nu sunt asociate cu liganzi, precum și riboswitch-uri asociate cu liganzii corecti sau liganzii foarte asemănători cu cei corecti. Aceste studii au concluzionat că riboswitchurile se leagă de liganzii lor corecti folosind o combinație de „selecție conformațională” și mecanisme de formă induse. Riboswitch-urile disting conexiuni similare în principal datorită inconsecvențelor spațiale, precum și formării de interacțiuni specifice. Majoritatea riboswitch-urilor sunt foarte specifice. De exemplu, diferența de legare a unui riboswitch purinic de adenină și guanină ajunge la 10.000 de ori, iar riboswitch-ul de lizină recunoaște lizina și ornitina , care sunt foarte asemănătoare ca structură, cu o diferență de 5.000 de ori [2] . Interesant, riboswitch-urile din aceeași clasă pot fi vizate pentru a recunoaște concentrații diferite ale aceluiași metabolit. Ele pot diferi și în parametrii termodinamici și cinetici, cu alte cuvinte, pot diferi prin prezența echilibrului între ARN și ligand natural [5] .
Originea și evoluția riboswitchurilor este una dintre cele mai interesante probleme în studiul ARN-ului. Experimentele in vitro au arătat că ARN-ul se poate adapta relativ ușor la legarea ligandului, așa că este nevoie de relativ puțin timp pentru ca selecția naturală să transforme secvențele de ARN în domenii de legare a metaboliților. Riboswitch-urile mai puțin obișnuite pot să fi apărut târziu în cursul evoluției. Mai multe dintre aceste evenimente ar putea da naștere la clase independente de riboswitch-uri specifice aceleiași conexiuni, cum ar fi SAM. În același timp, prezența ribocomutatoarelor TPP în toate cele trei domenii ale vieții mărturisește originea antică a acestui tip de ribocomutatoare și rezistența lor la presiunea evolutivă. Conform ipotezei lumii ARN , la un moment dat ARN-ul a acționat atât ca purtător de informații genetice, cât și ca catalizator al reacțiilor chimice. Capacitatea catalitică a riboswitch-ribozimei glmS , precum și capacitatea riboswitch-urilor de a interacționa cu coenzime „vechi” precum FMN, TPP și SAM, care au fost probabil răspândite în primele reacții biochimice , sugerează că molecule precum riboswitch-urile erau instrumente. care asigură existenţa şi evoluţia lumii primare a ARN-ului. Este probabil ca riboswitchurile să fi fost elementele de reglementare ale lumii ARN. Riboswitch-urile au supraviețuit până în zilele noastre, poate pentru că și-au creat o nișă de reglare metabolică care este mai potrivită pentru ARN decât pentru proteine. În același timp, reglarea cu ajutorul riboswitch-urilor este mai consumatoare de energie, deoarece implementarea sa necesită sinteza ARNm a genei reglementate. În același timp, reglarea cu ajutorul riboswitchurilor necesită mai puțini pași intermediari decât reglarea cu ajutorul unor proteine speciale [5] [2] .
Pe baza principiilor de funcționare a riboswitch-urilor, sunt dezvoltate noi comutatoare genetice artificiale. De exemplu, este posibilă modificarea aptamerului și obținerea unui nou element de control care recunoaște substanțele de care are nevoie cercetătorul. A fost dezvoltat un riboswitch artificial care nu numai că recunoaște elementul necesar, ci și se taie singur, adică are activitate ribozimă. Acest construct a fost numit „aptazim”, poate fi folosit în medicină pentru auto-taierea ARNm virală în celulă și, în consecință, suprimarea expresiei genelor virusului [6] . Riboswitchurile pot găsi aplicații și în terapia genică [7] . În plus, riboswitch-urile pot fi foarte utile în studiul biologiei bacteriene, de exemplu, ca instrument pentru crearea unor mecanisme artificiale pentru expresia genelor [8] [9] . O altă direcție în dezvoltarea ribozimelor artificiale este crearea de biosenzori care, ca răspuns la legarea de liganzi, emit un rezultat detectabil, de exemplu, un semnal electrochimic sau fluorescență [4] [10] . Au fost dezvoltate riboswitchuri fluorescente care fac posibilă vizualizarea modificărilor concentrațiilor metaboliților din celulele bacteriene [11] .
În 2016, a fost raportată crearea de „comutatoare termice” - integrarea termometrelor ARN sensibile la temperatură și a aptamerilor riboswitch într-o singură structură. Comutatoarele termice funcționează ca ribocomutatoare la temperaturi scăzute și reacționează la legarea cu ligandul lor prin schimbarea structurii, iar la temperaturi ridicate ele intră într-o stare permanent „pornită”. Astfel de regulatori artificiali de ARN pot fi folosiți pe scară largă pentru a regla expresia genelor [4] .
Riboswitchurile sunt considerate o țintă promițătoare pentru dezvoltarea de noi antibiotice . De exemplu, substanța rozoflavina se leagă direct de aptamerul riboswitch FMN, reprimând expresia genei corespunzătoare în Bacillus subtilis . În mod similar, aminoetilcisteina inhibă creșterea unor bacterii Gram pozitive prin legarea de riboswitch-ul lizinei. Cu toate acestea, activitatea antimicrobiană a compușilor de mai sus este redusă la nimic prin mutații în riboswitch-urile corespunzătoare [4] . Există riboswitch-uri care asigură rezistență la antibiotice . Astfel, riboswitch-ul aminoglicozidic este situat pe ARNm al enzimelor aminoglicozid acetiltransferaza și aminoglicozid nucleotidil transferaza, care asigură rezistență la antibioticele aminoglicozide. Când este legat de o aminoglicozidă, riboswitch-ul activează transcripția acestor enzime, oferind rezistență la antibioticele aminoglicozide [12] .
| Tipuri de ARN | |
|---|---|
| Biosinteza proteinelor | |
| procesarea ARN |
|
| Reglarea expresiei genelor |
|
| elemente de reglare cis | |
| Elemente parazite | |
| Alte |
|