ARN antisens

ARN-urile antisens sunt ARN-uri monocatenar care sunt complementare cu ARNm transcris în celulă sau cu gena țintă .  Mecanismele de acțiune ale ARN-urilor antisens sunt foarte diverse; ele pot atât suprima, cât și activa expresia genei țintă. ARN-urile antisens naturale se găsesc atât la procariote , cât și la eucariote [1] ; se referă la ARN lungi necodificatori ca ARN-uri mai lungi de 200 de nucleotide [2] . ARN-urile sintetice antisens au găsit o utilizare pe scară largă în rândul cercetătorilor ca instrument pentru distrugerea genelor . ARN-urile antisens găsesc și aplicații medicale [3] [1] [2] .

Istoria studiului

Primele ARN antisens au fost descoperite în timpul studierii proteinelor funcționale . De exemplu, când s-a studiat membrana exterioară a Escherichia coli , s-a demonstrat că unii promotori ai acestei gene pot suprima expresia altor porine membranare , cum ar fi ompF. S-a dovedit că o regiune lungă de 300 de nucleotide situată în amonte de promotorul ompC este de fapt implicată în suprimare. Este omoloagă în proporție de 70% cu secvența părții 5’-terminale a ARNm ompF , iar transcriptul citit din acesta (micF) se poate lega de acesta datorită interacțiunii complementare. S-a dovedit că în condiții de stres se exprimă micF, care formează un duplex cu ARNm ompF, determinând degradarea acestuia [4] .

Spre deosebire de micF, care a fost descoperit întâmplător, majoritatea ARN-urilor antisens au fost descoperite în timpul unei căutări țintite la nivelul întregului genom pentru ARN-uri de reglementare mici și analiză a transcriptomului . Cu toate acestea, majoritatea algoritmilor de analiză iau în considerare doar regiunile intergenice, iar ARN-urile antisens citite din catena ADN opusă șablonului (catena codificatoare) în regiunea regiunii codificatoare rămân nesocotite. Matricele de oligonucleotide pot fi utilizate pentru a detecta astfel de ARN antisens . Pentru a minimiza numărul de rezultate fals pozitive, recent au fost dezvoltate în mod activ metode de studiere a transcripției specifice unuia dintre lanțurile de ARN necodificant care interacționează cu cromatina și ARN- ul celulelor individuale [1] .

Ideea utilizării ARN-ului antisens în medicină a fost propusă pentru prima dată în 1978, când Zamecnik și Stephenson au obținut oligonucleotide antisens complementare ARN-ului virusului sarcomului Rous . S-a dovedit că au suprimat replicarea virală și sinteza proteinelor virale. De atunci, eforturi extraordinare au fost dedicate dezvoltării aplicațiilor medicale ale ARN antisens. Primul medicament de acest gen, fomivirsen, a fost aprobat de FDA în 1998. Acesta a fost destinat pentru tratamentul retinitei cu citomegalovirus la pacienții cu SIDA . Cu toate acestea, în 2004, medicamentul a fost întrerupt din cauza pierderii pieței [5] .

Distribuție și funcții

Primele ARN antisens au fost găsite în celulele bacteriene . Ele au fost codificate de plasmide , genomul bacteriilor înșiși și bacteriofagi . De exemplu, un ARN antisens cunoscut sub numele de ARN I este citit din plasmida ColE1 și joacă un rol important în determinarea numărului de copii ale plasmidelor și controlează replicarea acestora. În plus, este necesar un alt ARN antisens (ARN II) pentru replicarea plasmidei ColE1. Se hibridizează cu ADN-ul și acționează ca primer pentru replicare și este apoi degradat de RNaza H . Dacă ARN II nu reușește să hibridizeze cu ADN-ul ColE1, atunci numărul de copii ale acestei plasmide scade. În bacteriofagul P22 , ARN-ul sar antisens reglează tranziția de la ciclul lizogen la cel litic controlând expresia proteinei Ant [6] . ARN antisens au fost de asemenea găsite în plante . Cel mai studiat ARN antisens din plante este citit din gena FLC . La Arabidopsis thaliana , această genă corespunde unui factor de transcripție care suprimă expresia unui număr de gene care stimulează înflorirea . În condiții de frig, ARN-ul antisens al acestei gene, cunoscut sub numele de COOLAIR, este exprimat. Reprimă expresia FLC prin modificarea cromatinei, care induce înflorirea [7] . În celulele de mamifere , un exemplu tipic al acțiunii ARN-urilor antisens este inactivarea cromozomului X. ARN antisens Xist atrage complexul represiv polycomb 2 ( PRC2 ) la unul dintre cromozomii X , ceea ce determină heterocromatinizarea acestuia [8] .

Clasificare

ARN-urile antisens pot fi clasificate în diferite moduri. Unii autori le împart în ARN antisens care interacționează cu ARN, cu ADN și cu proteine ​​[8] . Ele pot fi, de asemenea, clasificate în funcție de tipul de promotor de la care începe expresia lor: promotori independenți, promotori bidirecționali sau promotori criptici. Lungimea poate fi, de asemenea, un factor de clasificare pentru ARN antisens. În timp ce majoritatea ARN-urilor antisens au peste 200 de nucleotide în lungime și, prin urmare, sunt ARN lungi necodificatori, unele sunt substanțial mai scurte. Deoarece majoritatea mecanismelor de acțiune ale ARN-urilor antisens sunt specifice speciei , ele pot fi, de asemenea, clasificate pe specii. Cu toate acestea, cea mai comună clasificare a ARN-urilor antisens se bazează pe modul în care transcripția acestor ARN-uri se corelează cu genele lor țintă [1] .

ARN-urile antisens reglatoare cis sunt transcrise la același locus cu ARNm-ul țintă, dar din catena de ADN opusă. Din acest motiv, ele sunt adesea aproape complet complementare cu gena țintă. Dacă acțiunea ARN-urilor antisens reglatoare cis este asociată cu ARNm, atunci doar un ARNm poate fi vizat de un ARN antisens. Acțiunea unor astfel de ARN antisens asupra ARNm se exprimă în blocarea accesului ribozomului la ARNm sau în atragerea RNazei , care distruge ARNm [4] . Printre ARN-urile antisens reglatoare cis , există șiamortizoare și activatori epigenetici . Ele pot provoca modificări epigenetice la locul din care au fost transcrise. Ele pot atrage proteinele care modifică cromatina la locusul țintă, ceea ce poate afecta expresia nu numai a genei țintă, ci și a genelor învecinate [8] .

ARN-urile antisens trans - regulatoare sunt transcrise din loci îndepărtați de genele țintă. Spre deosebire de ARN-urile reglatoare cis , acestea sunt slab complementare cu gena țintă, dar pot fi mai lungi decâtARN-urile reglatoare cis . De asemenea, pot viza mai multe loci. Datorită complementarității incomplete, complexele deARN antisens trans -regulatori cu transcriptele țintă nu sunt foarte stabile, iar chaperonele ARN sunt adesea necesare pentru funcționarea unor astfel de ARN . Datorită complexității acțiunii lor, ARN-urile trans - regulatoare nu sunt aproape niciodată considerate ca potențiale ținte de droguri [4] .

Mecanisme

Mulți ARN antisens suprimă transcrierea genelor țintă prin mecanisme epigenetice. De exemplu, ele pot provoca metilarea ADN-ului , care este adesea asociată cu o boală. Astfel, în alfa talasemie , expresia genei hemoglobinei a1 ( HBA1 ) este suprimată de transcriptomul anormal al genei LUC71. Acționează ca un ARN antisens și induce metilarea promotorului HBA1. În leucemia limfoblastică acută și leucemia mieloidă acută , gena supresoare tumorală p15INK4b este redusă la tăcere. Este cauzată de ARN-ul antisens ANRIL care este citit din același locus ca p15INK4b [8] . ARN-urile antisens pot provoca, de asemenea , metilarea histonelor , care poate duce atât la reprimarea, cât și la activarea genelor [9] . De exemplu, ANRIL nu numai că declanșează metilarea ADN-ului, ci și reprimă genele învecinate CDKN2B și CDKN2A , recrutând PRC2 la acestea, care introduce o marcă epigenetică represivă (H3K27me). Un alt exemplu este inactivarea cromozomului X la mamifere de către ARN antisens Xist [1] . Modificările cromatinei cauzate de ARN antisens pot fi, de asemenea, trans - regulatoare. De exemplu, la mamifere, ARN-ul antisens HOTAIR este citit din gena homeobox C (HOXC), dar recrutează PRC2 la HOXD. HOTAIR este exprimat activ în celulele cancerului mamar primar [1] .

ARN-urile antisens pot fi implicate în reglarea expresiei genelor nu numai în stadiul de inițiere a transcripției, ci și la alungirea și terminarea acesteia. De exemplu, transcripția bidirecțională apare uneori la procariote și eucariote, când două ARN polimeraze citesc aceeași genă din catenele opuse. În cele din urmă, se ciocnesc, ducând la întreruperea prematură a transcripției. Chiar dacă polimerazele se mișcă încet și este puțin probabil să se ciocnească, ele se pot opri, terminând prematur alungirea transcripției, ceea ce duce, de asemenea, la tăcere genetică. Prin acest mecanism, gena IME4 este reprimată de ARN-ul antisens RME2. ARN-urile antisens pot, de asemenea, perturba îmbinarea . De exemplu, traducerea ARNm ZEB2 necesită un IRES situat într-unul dintre introni . Când ARN-ul antisens al acestei gene este exprimat, maschează locul de îmbinare, ceea ce împiedică îndepărtarea IRES din transcript, permițând traducerea eficientă. În cele din urmă, nivelul de expresie a ARN antisens poate influența care izoforme ale transcriptului sens vor fi sintetizate [1] .

ARN-urile antisens pot acționa post-transcripțional, și anume, afectează direct traducerea ARNm-ului țintă. Ele pot bloca accesul ribozomilor la ARNm sau pot atrage RNaza H la ARNm. Uneori, totuși, ARN-urile antisens au un efect pozitiv asupra translației [1] .

Semnificație medicală

Ca elemente de reglementare care acționează foarte specific, ARN-urile antisens pot fi ținte de medicamente promițătoare. În plus, foarte puține molecule de ARN antisens sunt necesare pentru a obține efectul dorit , ceea ce le face ținte și mai convenabile. Ideea unei creșteri specifice a expresiei unei gene țintă datorită suprimării ARN-ului antisens corespunzător este în curs de dezvoltare. Datorită designului medicamentelor , este mult mai ușor să creezi un inhibitor decât un activator. Cu toate acestea, în unele cazuri este necesară creșterea expresiei unei gene țintă, de exemplu, o genă supresoare de tumoră. Acest lucru poate fi realizat prin suprimarea ARN-ului antisens corespunzător. În plus, în cazurile în care este necesară suprimarea genei țintă, ARN-ul antisens însuși poate acționa ca agent terapeutic. Cu toate acestea, ARN-urile introduse în celulă vor fi distruse rapid de RNazele, deci este necesar să le protejăm de degradare. Cel mai adesea acest lucru se realizează prin modificări chimice, cum ar fi adăugarea de fosforotioat . Cu toate acestea, modificarea fosforotioatului poate provoca inflamație . În plus, ARN-urile antisens pot avea efecte secundare foarte grave. În ciuda specificității ARN-urilor antisens endogene, doar 10-50% dintre oligonucleotidele sintetice acționează asupra genei țintă. Acest lucru se datorează probabil faptului că structura spațială nativă a ARN-urilor antisens joacă un rol important în recunoașterea țintei și protecția împotriva RNazelor. Înlocuirea unei singure nucleotide poate schimba foarte mult structura moleculei și poate afecta interacțiunea acesteia cu ținta. În cele din urmă, ARN-urile artificiale antisens pătrund foarte slab în celule. Neuronii și celulele gliale absorb cu succes oligonucleotidele goale, dar livrarea ARN-urilor antisens către alte tipuri de celule necesită dezvoltarea unor purtători speciali, cum ar fi veziculele lipidice sau virușii speciali [2] .

Medicamentul ARN antisens utilizat în prezent este mipomersen , aprobat de FDA în 2013. A fost dezvoltat pentru a regla nivelul de lipoproteine ​​cu densitate scăzută care conțin colesterol din sângele pacienților care suferă de hipercolesterolemie familială homozigotă , o boală genetică rară autozomal dominantă [10] .

Pentru mai multe detalii, consultați literatura de specialitate la articolul Terapia cu ARN ).

Note

1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 Pelechano V. , Steinmetz LM Reglarea genelor prin transcripție antisens.  (engleză)  // Nature Reviews. genetica. - 2013. - Decembrie ( vol. 14 , nr. 12 ). - P. 880-893 . doi : 10.1038 / nrg3594 . — PMID 24217315 .
2. ↑ 1 2 3 Wahlestedt C. Direcționarea ARN-ului lung necodificator pentru a regla în sus din punct de vedere terapeutic expresia genelor.  (engleză)  // Nature Reviews. descoperirea drogului. - 2013. - iunie ( vol. 12 , nr. 6 ). - P. 433-446 . - doi : 10.1038/nrd4018 . — PMID 23722346 .
3. ↑ Weiss B. , Davidkova G. , Zhou LW Terapia genică ARN antisens pentru studierea și modularea proceselor biologice.  (Engleză)  // Științe celulare și moleculare ale vieții : CMLS. - 1999. - Martie ( vol. 55 , nr. 3 ). - P. 334-358 . - doi : 10.1007/s000180050296 . — PMID 10228554 .
4. ↑ 1 2 3 Saberi F. , Kamali M. , Najafi A. , Yazdanparast A. , Moghaddam MM ARN antisens natural ca elemente de reglementare ARNm în bacterii: o revizuire a funcției și aplicațiilor.  (Engleză)  // Scrisori de biologie celulară și moleculară. - 2016. - Vol. 21 . - P. 6-6 . - doi : 10.1186/s11658-016-0007-z . — PMID 28536609 .
5. ↑ Kole R. , Krainer AR , Altman S. Terapia ARN: dincolo de interferența ARN și oligonucleotidele antisens.  (engleză)  // Nature Reviews. descoperirea drogului. - 2012. - 20 ianuarie ( vol. 11 , nr. 2 ). - P. 125-140 . - doi : 10.1038/nrd3625 . — PMID 22262036 .
6. ↑ Simons RW Controlul ARN antisens natural - o scurtă trecere în revistă.  (engleză)  // Gene. - 1988. - 10 decembrie ( vol. 72 , nr. 1-2 ). - P. 35-44 . — PMID 2468573 .
7. ↑ Ietswaart R. , Wu Z. , Dean C. Controlul timpului de înflorire: o altă fereastră la legătura dintre ARN antisens și cromatină.  (Engleză)  // Tendințe în genetică : TIG. - 2012. - septembrie ( vol. 28 , nr. 9 ). - P. 445-453 . - doi : 10.1016/j.tig.2012.06.002 . — PMID 22785023 .
8. ↑ 1 2 3 4 Magistri M. , Faghihi MA , St Laurent G 3rd. , Wahlestedt C. Reglarea structurii cromatinei prin ARN-uri lungi noncoding: se concentrează pe transcrierile antisens naturale.  (Engleză)  // Tendințe în genetică : TIG. - 2012. - august ( vol. 28 , nr. 8 ). - P. 389-396 . - doi : 10.1016/j.tig.2012.03.013 . — PMID 22541732 .
9. ↑ Whetstine, Johnathan R. Histone Methylation // Manual de  semnalizare celulară . - Al doilea. - P. 2389-2397. — ISBN 978-0-12-374148-6 . - doi : 10.1016/b978-0-12-374145-5.00287-4 .
10. ^ Wong E. , Goldberg T. Mipomersen (kynamro): un nou inhibitor de oligonucleotide antisens pentru managementul hipercolesterolemiei familiale homozigote. (Engleză)  // P & T: Un jurnal revizuit de colegi pentru managementul formularelor. - 2014. - Februarie ( vol. 39 , nr. 2 ). - P. 119-122 . — PMID 24669178 .