ARN circular ( ing. ARN circular, circRNA ) este un tip de molecule de ARN , ale căror capete sunt închise între ele folosind o legătură covalentă între nucleotidele terminale . CircARN-urile pot fi formate din introni sau din bucla din diferite regiuni ale transcriptului de maturare . Deși ARN-urile circulare sunt de obicei clasificate ca ARN-uri necodificatoare , acum se acumulează dovezi că pot codifica peptide [1] . Funcțiile specifice ale ARN-urilor circulare nu sunt pe deplin înțelese, dar sunt probabil implicate în reglarea expresiei genelor . ARN-urile circulare sunt deosebit de abundente în creier și circulă liber în plasma sanguină . Poate că în viitor, ARN-urile circulare vor fi folosite ca biomarkeri pentru diferite tipuri de cancer .
Teoretic, ARNc poate fi obținut în trei moduri diferite. În primul rând, în timpul îmbinării , intronii sunt îndepărtați din transcriptul de maturare nu ca un fragment liniar, ci ca un lasso. Dacă tăiați „coada” acestui lasso, obțineți ARN circular. Astfel de molecule circulare intrronice se acumulează în principal în nucleu și sunt denumite ciARN (din engleză circular intrronic long non-coding ARNs ). În al doilea rând, în transcriptul de maturizare, exonii individuali pot fi bucle, iar astfel de bucle pot fi excizate de spliceosome și închise covalent într-un inel. Așa se formează ARN-urile circulare, constând dintr-un singur exon. ARN-urile circulare, care constau exclusiv din exoni - unul sau mai mulți, sunt grupate în grupul ecircRNA (din engleză exonic circRNAs ) și se găsesc de obicei în citoplasmă . În al treilea rând, o regiune care conține câțiva introni și exoni poate fi buclă. Când o astfel de buclă este excizată și închisă de un spliceosome, se formează ARN circulare care conțin atât exoni, cât și introni. Ele sunt localizate în principal în nucleu și sunt denumite EIciRNA (din engleză exon-intron circRNAs ). Aceste molecule pot continua să se îmbine, iar după îndepărtarea intronilor, vor produce ARN circulari formați din mai mulți exoni [2] .
Procesul de excizie de către spliceosome a secțiunilor bucle ale transcrierii se numește backsplicing . Adesea, intronii care înconjoară un exon conțin repetări inversate complementare între ele , care, formând legături de hidrogen , formează „tulpina” buclei. Buclea poate avea loc cu participarea unor proteine speciale : doi monomeri ai unei astfel de proteine se leagă de cele două capete ale viitoarei bucle, se dimerizează și le aduc capetele împreună, astfel încât spliceozomul să le poată reticula covalent. Până în prezent, sunt cunoscute trei proteine care reglează formarea anumitor ARN circulari: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1-3) și Fusedinsarcoma ( FUS ). Astfel, Muscleblind reglează formarea circARN a propriei sale gene prin legarea de situsuri specifice din intronii transcriptului imatur. În plus, formarea circARN este dependentă de proteinele care se leagă de ARNm imatur la locurile de excizie a ARNc, făcându-le inaccesibile spliceozomului. Rezumând, putem spune că biogeneza cARN este un proces complex reglementat de o combinație de mulți factori, inclusiv localizarea repetărilor inversate și interacțiunea cu proteinele care mediază bucla sau, dimpotrivă, fac imposibilă backsplicing [2] .
Interesant este că în unele arhei , formarea ARNr -ului are loc prin etapa unei molecule precursoare circulare, care este apoi tăiată în ARNr-uri individuale [3] .
Nivelul sintezei cARN variază în funcție de tipul de celulă . În medie, ARN-urile circulare corespunzătoare sunt detectate pentru 5-20% din genele active, iar o celulă individuală conține simultan 5000-25.000 de ARN-uri. Cu toate acestea, ele reprezintă o parte foarte mică a transcriptomului : cu rare excepții, circRNA-urile reprezintă 5-10% din cantitatea de ARN mesager liniar sintetizat din aceeași genă. De regulă, mai multe izoforme circulare de ARN sunt transcrise dintr-o genă și cel mai adesea al doilea exon al genei este inclus în circARN, în timp ce primul și ultimul exon nu rămân aproape niciodată în formă circulară. Formarea uneia sau altei izoforme poate fi reglată. Nivelul sintezei circARN în general variază foarte mult în timpul diferențierii celulare , dar de obicei durează câteva zile sau chiar săptămâni pentru ca acesta să se schimbe semnificativ [2] .
Fără capete libere, ARN-urile circulare nu pot fi degradate de enzimele exonucleaze , care degradează multe transcrieri prin scindarea persistentă a nucleotidelor terminale. În acest sens, ARN-ul circular mediu este mai stabil decât ARNm liniar: ARN-ul circ trăiește 19-24 de ore (uneori până la 48 de ore), care este de 2-5 (până la 10) ori mai lungă decât durata de viață a moleculelor liniare. Există mai multe ipoteze despre modul în care ARN-urile circulare sunt degradate. ARN-urile circulare pot scinda endonucleazele , care nu distrug acizii nucleici de la capete, ci introduc rupturi în părțile interne ale moleculei. Probabil, în acest caz, un complex care conține miARN , care „induc” endonucleazele grupului Argonaute să țintă moleculele, este responsabil de distrugere. În ARN-urile care urmează să fie degradate, unele reziduuri de adenozină pot fi metilate în mod specific . Astfel de ARN-uri metilați sunt recunoscuți de proteine speciale care îi transferă în locurile de degradare a acizilor ribonucleici - așa-numitele P-bodies . În distrugerea circARN pot fi implicate organele speciale - autofagozomi , printre altele care conțin endonucleaze. Celulele pot elibera excesul de ARN circular în sânge ca parte a veziculelor extracelulare . Dacă există câteva confirmări experimentale pentru prima cale ipotetică de distrugere a ARN-urilor circulare, atunci modelele rămase încă așteaptă verificarea lor experimentală [2] .
Sunt descrise efectele biologice atât ale ARN-urilor circulare înșiși, cât și procesul de formare a acestora. În plus, ARN-urile circulare pot codifica peptide care îndeplinesc și anumite funcții celulare. Deși backsplicing care duce la formarea circARN este de 100 de ori mai rar decât splicing liniar obișnuit, este probabil ca aceste două procese să concureze între ele și să fie suprimate reciproc. Este posibil ca suprimarea splicing-ului liniar în timpul formării ARN-urilor circulare să fie principala funcție celulară a acestor molecule. Ieșirea în buclă din regiunea de transcriere imatură datorită legării complementare a repetăților inversate în introni poate suprima în mod eficient îmbinarea liniară. În plus, atât backsplicing cât și liniar splicing necesită aceleași regiuni ale transcrierii; de obicei, acestea sunt implicate într-un proces liniar, care în majoritatea cazurilor suprimă backsplicing. Într-adevăr, s-a demonstrat că ARN-urile circulare și ARNm-urile liniare obișnuite din aceeași genă nu sunt sintetizate simultan. Cu toate acestea, dovezile experimentale sugerează o relație mai complexă între liniară și backsplicing decât suprimarea competitivă convențională. Este posibil ca rata de transcripție să joace un rol important în care ARN-ul va fi citit din genă - ARNm sau circular. Astfel, splicing-ul alternativ duce adesea la formarea de lasso care conțin introni (adică posibili precursori ai ARN circular), iar acest lucru apare adesea atunci când transcripția este accelerată. Alegerea între backsplicing și splicing liniar se poate baza și pe mecanisme mai complexe. Se presupune, de exemplu, că ARN-ul circular, care este citit din gena mbl, preia întregul produs proteic al acestei gene, Muscleblind. Se știe că această proteină este necesară pentru formarea mbl-ARNm liniare, prin urmare, legându-se de ea și împiedicând-o să funcționeze, mbl-ARN-urile circulare (circMbl) inhibă sinteza „fraților” lor liniari. De asemenea, nu este exclusă posibilitatea legării complementare a ARN-urilor circulare la regiunile genelor care le-au dat naștere, adică la ADN [2] .
O serie de experimente sugerează că EIciRNA (exon-intron) și ciARN (intron) afectează transcrierea propriilor gene prin stimularea ARN polimerazei II . Cercetătorii au reușit să precipite complexul EIciRNA cu ARN polimeraza II folosind anticorpi și s-a dovedit că este necesară o altă componentă pentru a stimula polimeraza - ARN nuclear mic U1 . Poate că, atunci când interacționează cu EIciRNA, U1 este localizat în așa fel încât să stimuleze polimeraza. În același timp, ciRNA-urile par să fie capabile să se lege direct de cromatină în regiunea genelor „părinte” și să crească rata transcripției lor. A fost posibil să se precipite, de exemplu, ciARN numit ci-ankrd52 în complex cu o ARN polimerază II care funcționează activ (forma activă a enzimei se distinge printr-o fosforilare specială a domeniului C-terminal ). Deoarece ciRNA-urile se pot lega și de secvențe de ADN „străine”, rolul lor în controlul expresiei genelor poate fi semnificativ [2] .
Pentru două ecircARN (exonice, localizate în citoplasmă), a fost demonstrată experimental capacitatea de a influența sinteza proteinelor . circANRIL perturbă complexul de proteine care procesează ARNr, reducând astfel numărul de ribozomi funcționali și randamentul proteic. În același timp, circPABPN1 suprimă activitatea proteinei HuR , care este necesară pentru traducerea unui număr de ARNm [2] .
ARN-urile circulare pot servi ca bază structurală pentru asamblarea complexelor proteice și, astfel, pot oferi interacțiuni proteină-proteină . De exemplu, prin circ-Foxo3, kinaza 2 dependentă de ciclină (Cdk2) interacționează cu inhibitorul său , p21 , ducând la oprirea ciclului celular . În plus, ARN-urile circulare pot sechestra proteinele, limitând mișcarea acestora la locuri de muncă. Astfel, circ-Foxo3 menționat mai sus poate „bloca” factorul de transcripție E2F1 și alte proteine din citoplasmă [3] .
Unele ARN circulare exonice conțin situsuri de legare pentru regulatorii negativi ai expresiei genelor, microARN. În literatura engleză, astfel de circRNA sunt adesea denumite bureți microARN sau bureți care absorb microARN. Prin legarea de ele, microARN-urile nu mai pot interacționa cu ARNm țintă complementare și nu mai pot interfera cu traducerea lor. De exemplu, ARNc CDR1as conține 74 de situsuri de legare a microARN miR-7, iar ARNc de șoarece citit din gena Sry (important pentru determinarea sexului ) conține 16 situsuri de legare miR-138. Trebuie remarcat, totuși, că doar câteva ARN-uri circulare s-au dovedit că se leagă de microARN-uri, adică aceasta este mai degrabă excepția decât regula. Interesant este că circRNA-urile au fost găsite la unele eucariote unicelulare care nu au deloc microARN, și anume drojdia Saccharomyces cerevisiae și plasmodiul malaric Plasmodium falciparum . Astfel, legarea de microARN nu poate fi funcția principală a ARN-urilor circulare [2] .
O serie de ARN-uri circulare joacă un rol important în imunitatea antivirală . De exemplu, puii care sunt rezistenți la virusul leucemiei aviare produc 12 circARN în cantități mai mari decât puii obișnuiți. Multe dintre aceste molecule se leagă de microARN care reglează expresia genelor care sunt asociate cu procese imune, cum ar fi activarea limfocitelor B și prezentarea antigenului . În mod curios, sistemul imunitar influențează și sinteza ARN-urilor circulare. De exemplu, factorii imunitari NF90 și NF110 (variante de îmbinare ale genei ILF3 ) stimulează formarea circARN dintr-un transcript în maturare din nucleu. În condițiile unei infecții virale, aceste proteine ajung în citoplasmă, unde se leagă de ARNm viral și inhibă ciclul de viață al virusului ; cantitatea de circARN nuclear scade, care poate modula expresia genelor. CircARN-urile pot participa, de asemenea, la suprimarea infecției prin legarea de miARN virale sau celulare care interferează cu răspunsul imun [3] .
Se știe că majoritatea evenimentelor de backsplicing implică exoni și apar în ARN-ul genelor care codifică proteine. Translația majorității ARNm începe cu recunoașterea de către ribozom a unei nucleotide modificate la capătul 5’ al ARNm, așa-numita capac . CircARN-urile nu au un capăt liber 5', deci nu pot avea un capac. Cu toate acestea, unele ARN-uri celulare și virale pot fi traduse în absența unui capac cu participarea unei secvențe speciale - IRES . Același lucru s-ar putea întâmpla cu ARN-urile circulare [2] [3] .
Într-adevăr, ARN-urile artificiale care conțin IRES și care codifică unele peptide ar putea fi traduse. Cu toate acestea, s-a demonstrat că majoritatea ARN-urilor circulare din celulele vii nu sunt asociate cu ribozomi, așa că este puțin probabil ca traducerea lor să fie larg răspândită. Până în prezent, se cunosc două ARN-uri circulare care sunt susceptibile de a sintetiza proteine in vivo , acestea sunt circMbl și circZNF609. Este de remarcat faptul că aceste molecule sunt formate oarecum nestandard: în primul caz, backsplicing afectează primul exon, care, după cum ne amintim, de obicei nu este inclus în ARN-urile circulare, iar în al doilea, un fragment din 5'. -regiunea netradusă a transcriptului original intră în circARN, care are proprietățile IRES. Este posibil ca sinteza proteinelor prin circARN să fie posibilă numai în condiții speciale, de exemplu, în condiții de stres — șoc termic sau înfometare [2] .
Dacă presupunem că un anumit ARN circular conține un cadru de citire deschis cu un număr de nucleotide care este un multiplu de trei, atunci teoretic translația unui astfel de ARN poate avea loc conform mecanismului inelului de rulare . Rezultatul unei astfel de translații ar fi teoretic un lanț nesfârșit de blocuri repetate de aminoacizi , iar creșterea sa ar fi limitată de procesivitatea ribozomilor. Cazuri similare nu sunt încă cunoscute pentru ARNc-urile celulare, dar ceva similar se întâmplă cu ARNc-ul viroid asociat cu virusul petei galbene de orez [2] .
Progresele recente în detectarea ARNc se datorează îmbunătățirilor în tehnologia de secvențiere a ARN , cum ar fi creșterea lungimii citirilor individuale îmbunătățirea algoritmilor pentru potrivirea ARN-ului cu genele cunoscute și extinderea bibliotecilor de ARN ARN-urile circulare pot fi distinse de ARN-urile liniare folosind o abordare bioinformatică (pe baza rezultatelor secvențierii) sau o metodă „umedă” folosind exonucleaze. După cum sa menționat mai sus, aceste enzime scindează rapid ARN-urile liniare, dar lasă ARN-urile circulare neafectate. Mii de ARN-uri circulare au fost identificate folosind exonucleaze, dar majoritatea ARN-urilor circulare au fost descrise datorită secvențierii cu randament ridicat folosind algoritmi speciali [4] .
În prezent, există mai multe baze de date dedicate ARN-urilor circulare și instrumente online pentru lucrul cu acestea. Printre acestea [5] :
ARN-urile circulare se găsesc în cantități diferite în plasma sanguină, iar în sângele periferic sunt chiar mai numeroase decât în celulele organelor . Motivele pentru aceasta nu sunt clare, mai ales având în vedere faptul că în ser de 25%, circRNA-urile sunt degradate după doar 30 de secunde (ARN circular mediu există în celulă timp de 1-2 zile). Oricum ar fi, prezența și cantitatea anumitor ARN circulari în plasma sanguină poate servi ca un indicator important al sănătății organismului. Cu alte cuvinte, ARNc-urile pot fi utilizate ca biomarkeri pentru diagnosticarea și stadializarea patologiilor , cum ar fi boala coronariană , diferite tipuri de cancer (inclusiv leucemia ), diabetul și scleroza multiplă [2] .
Unele ARN circulare sunt asociate cu senescența celulară . Astfel, circPVT1 acționează ca un inhibitor al îmbătrânirii fibroblastelor în proliferare [4] . O serie de ARN-uri circulare sunt asociate cu schimbări legate de vârstă în organism: de exemplu, au fost identificate molecule asociate cu îmbătrânirea musculară la maimuțe [6] .
Până în prezent, se știe că 10 ARN circulari sunt implicați în dezvoltarea bolilor cardiovasculare și metabolice (de exemplu, diabetul zaharat). CirANRIL deja menționat poate proteja împotriva aterosclerozei prin inhibarea maturării ARNr și prin aceasta inhibarea diviziunii celulare , a cărei proliferare excesivă duce la formarea plăcilor aterosclerotice . Un ARN circular numit MICRA poate semnala disfuncția ventriculară stângă din cauza infarctului miocardic . Cu hipertrofia inimii și insuficiența cardiacă , se observă o scădere a sintezei unui număr de ARN circulari [2] .
S-a demonstrat că unele ARN celulare sunt asociate cu diabetul zaharat. Se știe că supraproducția de microARN miR-7 în celulele β pancreatice contribuie la dezvoltarea diabetului zaharat, în timp ce supraproducția de ciRS-7, un ARN circular care leagă miR-7, în aceste celule, dimpotrivă, îmbunătățește secreția de insulină . 4] .
În țesuturile nervoase ale diferitelor organisme (de la muștele de fructe la oameni), în special se găsesc multe ARN circulare. Poate că acest lucru se datorează prevalenței mai mari a splicing-ului alternativ în neuroni . În plus, ARN-urile circulare din ele pot îndeplini funcții speciale legate de conducerea impulsurilor nervoase . Proteina Qki , implicată în formarea circARN, este implicată în dezvoltarea oligodendrocitelor și reglează mielinizarea , precum și inhibă formarea dendritelor în sistemul nervos central . Mutațiile din gena acestei proteine sunt asociate cu ataxie și schizofrenie [2] . Există, de asemenea, dovezi ale unei asocieri a ARN-urilor circulare cu boala Alzheimer [4] [6] .
Mai mult de 20 de ARNc au fost legate de dezvoltarea diferitelor tipuri de cancer, cum ar fi cancerul colorectal , ovarian , de vezică urinară , de sân , de ficat , de stomac , de rinichi și de prostată . Procesele oncologice sunt adesea însoțite de translocații , care duc la apariția unor specii de circARN specifice tumorii . Cel mai adesea, cRNA-urile asociate cancerului funcționează ca bureți pentru miARN [2] .