Протео́мика (англ. proteomics) — область молекулярной биологии, посвящённая идентификации и количественному анализу белков (иными словами, высокопроизводительному исследованию белков). Термин «протеомика» был предложен в 1997 году[1]. Совокупность всех белков клетки называют протеомом[2].
Объектом изучения протеомики являются белки, которые экспрессируются в данной клетке, ткани или организме в данный момент времени (то есть протеом). Хотя первые методы протеомики, например, секвенирование белков по Эдману, появились задолго до геномных технологий, действительно высокопроизводительное изучение белков стало возможным только в постгеномную эпоху, то есть при наличии известных нуклеотидных последовательностей геномов разных организмов.
После геномики и транскриптомики , протеомика — следующий шаг в изучении биологических биологичестем . Основная задача протеомики заключается в идентификации новых белков и их колинлнаествестве. Соответственно, протеомика объективно сложнее геномики, так как геном организма в большинстве случаев не меняется в ходе жизни, но совокупность всех его белков изменяется постоянно. Различаются даже протеомы клеток разных типов одного организма. Кроме того, изучение протеома осложняется и другими обстоятельствами, например, посттрансляционными модификациями , которым подвергаются многие белки (изучением посттрансляционных модификаций занимаются разделы протеомики — фосфопротеомика и гликопротеомика ). Для активности многих белков критически необходимы взаимодействия с другими белками и с РНК , что также осложняет их идентификацию. Наконец, некоторые белки существуют так недолго и столь быстро разрушаются, что их очень сложно зафиксировать имеющимися методами [3] .
Данные, полученные методом протеомики, могут быть использованы для формирования более глубокого понимания причин возникновения разнообразных заболеваний, например, нейродегенеративных, а также разработки методов лечения. С помощью протеомики осуществляется поиск антигенов, пригодных для создания новых вакцин. Идентификация белков, которые аномально экспрессируются при различных раковых заболеваниях, имеет огромное значение для диагностики с помощью биомаркеров, прогнозирования и лечения рака[4].
Это стало возможным благодаря появлению и развитию таких методов и технологий, катологий , казвитию появлению Однако методы протеомики не исчерпываются этими двумя примерами [2] . Ниже рассмотрены использующиеся на данный момент методы исследования белков, в том числе методы количественного анализа и секвенирования аминокислотной последовательности белка, которые на современном этапе используются редко.
Количественный анализ белков с ферментативной активностью можно опосредованно проводить через определение активности этих белков. Ещё в начале XX века подобный анализ можно было осуществить с помощью методов спектрофотометрии. При этом количество катализатора оценивается в условных единицах активности. Условные единицы активности до сих пор используют для описания концентрации в крови таких биомаркеров, как аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза. В 1975 году был разработан способ получения моноклональных антител, и они быстро нашли применение в исследовании белков. Например, если известен антиген данного антитела, то с помощью этого антитела можно идентифицировать исследуемый антиген в экспериментальном образце. В медицине в качестве биомаркеров и в XXI веке широко используются антитела, антигены которых неизвестны, но которые связывают у больных людей гораздо больше антигена, чем у здоровых. Например, гликопротеин CA-125 использовали как биомаркер рака яичников с 1981 года, когда были получены антитела к нему. Значительно позднее идентифицировали сам белок — муцин 16[5].
В 1953 году Фредерик Сенгер определил аминокислотную последовательность гормона инсулина. Для мечения и идентификации N-концевого остатка Сенгер предложил использовать 1-фтор-2,4-динитробензол. После связывания с этим реагентом N-концевого остатка белка полипептидную цепь гидролизуют соляной кислотой до отдельных аминокислот и выявляют меченный остаток. Если белок состоит из нескольких полипептидных цепей, то пометятся оба N-концевых остатка, то есть будет установлено число отдельных полипептидных цепей в белке. Для секвенирования всей белковой последовательности чаще применяют метод секвенирования по Эдману[6].
В 1950-х годах шведский химик Пер Эдман изобрёл метод определения аминокислотной последовательности белков (секвенирование). Первый этап секвенирования по Эдману — обработка исследуемого пептида изотиоцианатом фенила, который взаимодействует с аминогруппой, давая фенилтиокарбомоильный радикал. При умеренном закислении раствора он отщепляется, захватывая вместе с собой N-концевую аминокислоту. В результате в раствор выходит тиазолинон с радикалом, специфичным для данной аминокислоты. Это производное анализируют хроматографически, определяя, какая аминокислота была на N-конце, и цикл повторяется. Если исследуемый белок закреплён на твёрдой подложке, то после каждой обработки изотиоцианатом фенила его можно промывать, удаляя тиазолинон с N-концевой кислотой, и начинать новый цикл. Метод Эдмана позволяет с высокой точностью определять последовательность длиной до 30 аминокислотных остатков. Высокая чувствительность метода также позволяет секвенировать менее 0,1 нмоль пептида с 99 % точностью. Длина полипептидной цепи, которую можно секвенировать методом Эдмана, зависит от эффективности отдельных стадий, которая, в свою очередь, определяется аминокислотным составом полипептида[7].
В 1960-х годах был создан автоматический секвенатор, реализующий метод Эдмана. Первичную структуру инсулина, на определение которой у Сенгера ушло более 10 лет, в настоящее время можно получить за пару дней прямым секвенированием на белковом секвенаторе[7]. Метод Эдмана сейчас изредка используют при исследовании организмов, геномные последовательности которых неизвестны[8][9][10]. Традиционное секвенирование белков также применяют в тех случаях, когда многие их особенности (например, посттрансляционные модификации) нельзя узнать только лишь из последовательности гена[11].
Большинство белков перед секвенированием необходимо приготовить к нему особым образом. Сначала в белке́ разрушают дисульфидные связи, если они есть, при помощи окисления надмуравьиной кислотой или восстановления дитиотреитолом. Далее белковую цепь дробят на фрагменты протеазами, поскольку секвенирование длинных белков имеет невысокую точность. Обычно для гидролиза используют трипсин, который действует только на те пептидные связи, карбонильная группа которых принадлежит остатку лизина или аргинина. Поэтому, если при полном гидролизе определить число лизиновых и аргининовых остатков в белке, можно предсказать, на сколько фрагментов распадётся белок после обработки трипсином. Полученные фрагменты далее чистят с помощью электрофореза (см. ниже) или хроматографии и секвенируют по Эдману. Чтобы восстановить последовательность белка по фрагментам, его разрезают на куски ферментом, который распознаёт остатки, отличные от тех, которые распознаёт трипсин. На основании перекрытий двух полученных наборов фрагментов восстанавливают полную аминокислотную последовательность белка[12].
Pentru a determina poziția legăturilor disulfurice, proteina este din nou scindată cu tripsină, dar fără a distruge mai întâi legăturile disulfurice. Fragmentele rezultate se separă prin electroforeză și se compară cu setul de fragmente obținut prin prima digestie cu tripsină.
În anii 1970 și 1980, metodele de izolare și purificare a proteinelor au înflorit. Aceste metode au combinat principiile cromatografiei, electroforezei și centrifugării ; multe dintre ele au căzut de mult în uz, dar unele sunt încă folosite în secolul XXI. În 1970, omul de știință elvețian Ulrich Laemmli a propus o metodă de separare a proteinelor folosind electroforeza în condiții de denaturare . În primul rând, proteinele au fost supuse unei denaturari severe sub acțiunea dodecilsulfatului de sodiu ( în engleză dodecilsulfat de sodiu, SDS ), care a acoperit fiecare moleculă de proteină sub formă de strat . Cu cât proteina este mai mare, cu atât SDS se leagă mai mult de aceasta și cu atât este mai mare sarcina negativă dobândită de complexul lor. Prin urmare, la aplicarea probelor pe gelul de poliacrilamidă , acestea au început să se miște sub acțiunea unui câmp electric ; în același timp, viteza de mișcare a moleculelor proteice depinde de masa lor (proteinele mai ușoare se deplasează mai repede prin gel). Metoda este potrivită pentru separarea proteinelor cu o masă de 5 până la 250 kDa [14] .
Metoda lui Laemmli a fost dezvoltată în continuare.
Când este utilizat, proteinele din lizatul studiat sunt mai întâi separate prin electroforeză pe gel și transferate din gel pe o membrană poroasă. Apoi, membrana este tratată secvenţial cu anticorpi specifici proteinei ţintă şi anticorpi marcaţi radioactiv care se leagă de primii anticorpi. Ca urmare, moleculele proteinei țintă, recunoscute de anticorpi, sunt detectate ca benzi pe autoradiogramă sau pete pe membrană, prin care proteina poate fi identificată [18] [19] .
Масс-спектрометрия включает ряд методов, которые направлены на определение молекулярной массы исследуемых соединений. Она нашла широкое применение и в биологии, в особенности в протеомике. При применении масс-спектрометрии сначала белки, находящиеся в образце, ионизируют, потом в условиях вакуума ионы сортируются и детектируются, давая на выходе спектр, который дальше анализируется специальными вычислительными методами. В конечном итоге для каждого иона определяется значение отношения массы к заряду. Если заряд иона равен единице, то отношение численно равно его молекулярной массе. Поначалу использование масс-спектрометрии в биологии было ограничено из-за того, что ионизация была очень жёсткой и приводила к разрушению молекул. В 1980-х годах был разработан метод ионизации молекул лазером при их сокристаллизации со светочувствительным органическим веществом (его называют матрицей). Матрица окружает молекулы исследуемого вещества и под действием лазера ионизирует соседние молекулы. В некоторых условиях ионизацию можно провести без разрушения исследуемых молекул. Этот метод получил название опосредованная матрицей лазерная десорбция-ионизация (англ. matrix-assisted laser desorption ionisation, MALDI). Новый метод ионизации совместили с обычным масс-спектрометрометрическим детектором (времяпролётным, англ. time-of-flight, TOF). В этом детекторе ионы движутся в вакуумной трубке и достигают чувствительной пластины (фотоэлектронного умножителя), которая и является детектором. Время, за которое ион преодолевает длину трубки, обратно пропорционально его массе. В 1990-е и в начале 2000-х годов метод MALDI-TOF очень активно использовался для исследований белков[20][21].
Из-за особенностей изотопного разделения пики в спектрах больших белков чрезвычайно сложно анализировать. По этой причине перед исследованием их с помощью фермента трипсина разрушают на пептиды массой 500—2500 Да, и затем по данным для пептидов восстанавливают информацию об исходном белке подобно тому, как при секвенировании нуклеиновых кислот нового поколения исходные последовательности собираются из коротких прочтений. Этот подход называется «протеомикой снизу вверх» (англ. bottom-up). Процесс сборки небезошибочен и приводит к большим потерям информации, поэтому в некоторых случаях исследуются целые белки без расщепления с помощью мощных детекторов сверхвысокого разрешения («протеомика сверху вниз», англ. top-down)[22].
Набор молекулярных масс пептидов, которые были получены при обработке белка трипсином, уникален для каждого белка. Это связано в основном с высокой специфичностью трипсина, который вносит разрез только по остаткам лизина и аргинина. Сравнивая полученную картину молекулярных масс пептидов для исследуемого белка с пептидными картами белков из баз данных, можно установить, какой именно белок исследовался. Этот подход получил название пептидной дактилоскопии[23]. Поскольку полного соответствия экспериментального распределения масс пептидов и эталонных пептидных карт достичь невозможно, была введена количественная оценка (англ. score) вероятности того, что экспериментальная пептидная карта соответствует данной теоретической. Для пептидной дактилоскопии были разработаны специальные программы, например, MOWSE[24].
Вместо фрагментации трипсином перед установкой образцов в масс-спектрометр фрагментацию белков на фрагменты можно осуществлять в самом масс-спектрометре, например, при помощи столкновения с молекулами инертных газов. При этом каждый пептид характеризуется массой иона-предшественника и набором масс ионов-фрагментов. Массы фрагментов можно измерить и по ним восстановить информацию об исходном белке, так как молекулярные массы фрагментов можно найти исходя из последовательности пептида. Такой подход получил название тандемной масс-спектрометрии (MS-MS). Как и при пептидной дактилоскопии, в тандемной масс-спектрометрии имеет место вероятностная оценка того, что пептидная карта исследуемого белка соответствует одной из теоретических. В 2007 году для анализа данных тандемной масс-спектрометрии был предложен подход target-decoy. Суть этого подхода заключается в том, что при анализе данных к целевым теоретическим пептидам (англ. target — цель) стали добавлять равное количество бессмысленных, фальшивых (англ. decoy — ложная цель) пептидов. Этот подход позволяет оценить качество анализа. Если анализ в качестве лучших соответствий выдаёт соответствие экспериментального белка с заведомо фальшивым, то он даёт ложноположительный результат, а подход target-decoy позволяет оценить долю ложноположительных результатов[25].
Ca alternativă la MALDI, ionizarea peptidelor înainte de spectrometria de masă poate fi efectuată folosind metoda ionizării prin electrospray ( ESI ) . Un lichid care conține proteinele studiate este plasat într-un capilar conic, iar atunci când iese din capilar, i se aplică o tensiune puternică . Ca rezultat, lichidul se transformă într-un aerosol, iar atunci când particulele de aerosol se evaporă într-un flux de gaz inert, sarcina se poate transfera către biomoleculele dizolvate în aerosol , inclusiv proteinele. Ionizarea prin electrospray poate fi ușor combinată cu cromatografia lichidă de înaltă performanță : fluxul fazei cromatografice din coloană poate fi direcționat direct în capilarul electrospray. Identificarea proteinelor într-o soluție complexă folosind o combinație de spectrometrie de masă și cromatografie lichidă de înaltă performanță se numește proteomică cu pușcă [27 ] .
Методы масс-спектрометрии могут быть использованы для направленного обнаружения искомых белков, то есть масс-спектрометр можно настроить таким образом, чтобы он видел только нужный пептид. Для этой цели используют прибор с детектором типа тройного квадруполя, то есть три одинаковых масс-спектрометра, последовательно передающие друг другу ионы. Первый масс-спектрометр отфильтровывает интересующий пептид, во втором он фрагментируется, а третий регистрирует от 3 до 5 заранее выбранных фрагментов. Количественный анализ производится на основе интенсивности фрагментов. Этот метод известен как мониторинг множественных реакций (англ. multiple reaction monitoring, MRM), или мониторинг выбранных реакций (англ. selected reaction monitoring, SRM)[28].
Один из наиболее популярных методов изучения белок-белковых взаимодействий — использование дрожжевой двугибридной системы. Для этой цели получают два штамма гаплоидных дрожжей, один из которых исследуемый белок (приманка), а второй — белок, который необходимо проверить на предмет взаимодействия с первым (добыча). Далее гаплоидные клетки сливают с образованием диплоидных клеток дрожжей, экспрессирующих оба белка. Если белки взаимодействуют, то они оба составят транскрипционный фактор, запускающий экспрессию репортёрного гена. Если же взаимодействия между белками нет, то и экспрессия репортёрного гена не запускается. С помощью такого подхода у дрожжей S. cerevisiae при скрининге 6000 клонов добычи против 6000 клонов приманки удалось идентифицировать 691 белок-белковое взаимодействие, из которых только 88 были известны ранее[29]. В XXI веке для исследования белок-белковых взаимодействий применяются и другие методы, такие как плазмонный резонанс[30][31].
De exemplu, dacă se știe că o proteină interacționează cu mai multe proteine în aceeași cale metabolică , este probabil să fie și ea implicată în ea.
Datele privind interacțiunile proteină-proteină sunt extrem de importante pentru rețelele biologice și biologia sistemelor : ele sunt utilizate, de exemplu, în reconstrucția cascadelor de semnalizare [33] [34] .
Белковые микрочипы разрабатываются для идентификации определённых белков в образце. По аналогии с ДНК-микрочипами, на твёрдую подложку наносятся очень маленькие капли, содержащие антитела. В каждой капле находятся меченые антитела к одному определённому белку, который добавляется на чип в виде флуоресцентно-меченной пробы. После промывки флуоресценция детектируется только в тех каплях, в которых антитела связали исследуемый белок. Вместо антител можно использовать другие молекулы, специфически взаимодействующие с конкретными белками, например, олигонуклеотиды[35]. Белковые микрочипы также можно использовать для обнаружения белок-белковых взаимодействий и определения функций белков. В 2000-е годы белковые микрочипы автоматизированы. Они обладают высокой чувствительностью и требуют совсем небольшого количества исследуемого белка, благодаря чему отличаются экономичностью[36].
Folosind spectrometria de masă și cipuri, puteți obține informații despre fragmentele de proteine, dar nu despre întreaga proteină. În această privință, s -au creat programe care, din date fragmentare ale spectrometriei de masă și cipurilor, furnizează date despre proteine aproape complet asamblate din aceste fragmente. Aceste programe se bazează pe construcția alinierilor de fragmente cu proteine cunoscute din bazele de date UNIPROT [37] și PROSITE [38] .
В большинстве программ, анализирующих белки, не учитываются их посттрансляционные модификации[39]. Существующие инструменты, определяющие посттрансляционные модификации, имеют лишь предсказательный характер[40].
Вычислительные методы биоинформатики активно используются для изучения белков-биомаркеров. Так, с помощью компьютерных моделей удалось показать интенсивный обмен белками между организмом матери и плодом при беременности, причём для анализа требовался лишь неинвазивный забор крови у матери[41].
Развивается такое направление, как протеогеномика, которая использует методы протеомики для подтверждения данных, полученных из геномных последовательностей[42][43]. Существует также структурная протеомика, которая занимается широкомасштабным исследованием структур белков на основе данных рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии[44].
Последние достижения в количественной протеомике позволяют использовать её для глубокого анализа клеточных систем[33][34]. Описание поведения биологических систем в ответ на разнообразные воздействия (действия внешних факторов, изменения клеточной физиологии в связи с разными фазами клеточного цикла и тому подобные) на уровне изменения белкового состава позволяют глубже понять суть многих биологических процессов. Благодаря этому протеомику, наряду с геномикой, транскриптомикой, эпигеномикой, метаболомикой и другими «-омиками», включают в состав нового научного направления — системной биологии. Так, Атлас протеома раковых клеток (англ. The Cancer Proteome Atlas) содержит количественные данные об экспрессии около 200 белков в более чем 4000 проанализированных опухолевых образцах, дополняя Атлас ракового генома (англ. The Cancer Genome Atlas), содержащий геномные и транскриптомные данные для этих белков[45].
Cu MALDI-TOF, agenții patogeni pot fi identificați la genuri și specii . Celulele bacteriene intacte sunt aplicate pe o țintă metalică a unui spectrometru de masă, acoperită cu o matrice, iradiată cu un laser și se obțin profile specifice, pe care algoritmul antrenat le recunoaște după mase caracteristice [46] .
De exemplu, în Statele Unite , este permisă utilizarea testului Xpresys Lung, dezvoltat în 2015, care folosește spectrometria de masă țintită a mai multor proteine din plasma sanguină și evaluează gradul de malignitate a nodulilor tumorali din plămâni [47] .
Новейшие достижения протеомики — в области масс-спектрометрии, разделении белков органелл и мембранных белков — могут сделать возможными исследование протеома сердца и идентификацию модифицированных белков (а также определять характер их модификации). Данные по протеому сердца помогут понять механизмы разнообразных сердечно-сосудистых заболеваний[48].
Multe medicamente sunt fie proteine în sine, fie acționează pe proteine specifice. Prin urmare, proteomica a fost adoptată de specialiști implicați în dezvoltarea de medicamente . Majoritatea companiilor farmaceutice au o divizie proteomică sau o companie parteneră specializată în proteomică. Metodele proteomice sunt utilizate pentru a confirma validitatea țintelor medicamentelor dezvoltate, a determina eficacitatea biomarkerilor, a studia mecanismul de acțiune a medicamentului și toxicitatea acestuia . Metodele proteomice sunt utilizate, în special, pentru a căuta medicamente antimalarice care se leagă de proteinele care leagă purinele în stadiul reproducerii plasmodiului în eritrocite și eliberării lor în sânge [48] .
Comparația proteomilor a două organisme (nu neapărat strâns legate) face posibilă identificarea atât a proteinelor comune acestor două organisme, cât și a proteinelor care provoacă diferențe în fenotipurile lor .
Istoria proteomicii datează din 1950, când Edman a propus o metodă de secvențiere a proteinelor. În 1958, echipa de cercetare a lui Frederick Sanger a determinat secvența de aminoacizi a insulinei . În 1959, a luat naștere metoda imunotestului , care este de mare importanță pentru studiul proteinelor. În 1967, a fost creat primul secvențietor automat care determină secvențele de aminoacizi ale proteinelor folosind metoda Edman. În 1970, Laemmli a propus o metodă de separare a proteinelor utilizând electroforeză în gel de poliacrilamidă denaturantă, iar în 1975, pe baza acesteia a fost propusă o tehnică de electroforeză bidimensională. În 1984, a fost inventată metoda de ionizare prin electrospray, care a făcut posibilă studierea proteinelor folosind spectrometria de masă fără a le distruge, iar în 1985 a fost propusă metoda de ionizare MALDI. În prezent, nu există doar dezvoltarea și îmbunătățirea metodelor de proteomică, precum diverse tipuri de spectrometrie de masă, ci și noi programe de interpretare a datelor proteomice [52] .