Epigenomica

Epigenomica este o  ramură a biologiei moleculare care studiază totalitatea modificărilor epigenetice ale materialului genetic al unei celule ( epigenom ) utilizând metode cu randament ridicat. Epigenomica este similară cu genomica și proteomica , care studiază genomul și respectiv proteomul unei celule [1] .

Modificările epigenetice sunt modificări chimice covalente reversibile ale ADN-ului celular și histonelor care afectează expresia genei fără a modifica secvența nucleotidelor ADN [2] . Mecanismele de realizare a modificărilor covalente ale ADN-ului și histonelor și influența lor asupra expresiei genelor fac obiectul studiului epigeneticii, iar epigenomica studiază rezultatul - modificări epigenetice și distribuția lor în întregul genom folosind metode moleculare precum ChIP-seq , secvențierea bisulfiților , si altii.

Modificările epigenetice cele mai studiate sunt metilarea ADN-ului și modificările histonelor. Studiul epigenomului la nivel global a devenit posibil doar relativ recent datorită dezvoltării metodelor de mare debit pentru studierea genomului [3] [4] .

Modificări epigenetice

Modificările genomului care modifică expresia genei , dar nu sunt asociate cu o modificare a secvenței primare de ADN (secvența de nucleotide ) și sunt transmise în timpul diviziunii celulare mitotice și meiotice , sunt numite modificări epigenetice. Modificările epigenetice cele mai studiate sunt metilarea ADN-ului și modificările histonelor [2] . Totalitatea tuturor modificărilor epigenetice ale ADN-ului dintr-o celulă se numește epigen. Celula își menține epigenomul pe tot parcursul vieții, deoarece stabilitatea epigenomului este direct legată de stabilitatea genomului, deoarece epigenomul este implicat în cele mai importante procese celulare, de exemplu, repararea ADN-ului [5] [6] . Modificările în epigenomul unei celule pot duce la transformarea acesteia într- una malignă [7] [4] [8] . Modificările epigenomului pot fi asociate cu dezvoltarea altor boli umane, pe lângă diferite tipuri de cancer , precum diabetul zaharat de tip 2 , boala Alzheimer, boala Parkinson , sindromul X fragil și sindromul Prader-Willi [9] .

Metilarea ADN-ului

Prima modificare epigenetică cunoscută a fost metilarea ADN-ului. Metilarea ADN-ului este adăugarea unei grupări metil la nucleotidele din ADN. Enzimele care catalizează această reacție sunt cunoscute ca ADN metiltransferaze . Deși metilarea ADN-ului este o modificare stabilă și moștenită , există enzime care îndepărtează semnele de metil din ADN ( ADN demetilazele ). La eucariote, gruparea metil se atașează cel mai adesea la al cincilea atom de carbon al bazei azotate a citozinei din ADN pentru a forma 5-metilcitozină , sau 5mC (de regulă, ca parte a insulelor CpG , în care citozina reziduurile sunt adiacente reziduurilor de guanină ) [3] [10] .

Pozițiile nucleotidelor aflate în curs de metilare variază considerabil între specii și chiar între celulele aceluiași organism. Animalele folosesc metilarea ADN-ului în moduri diferite; Astfel, nivelul de metilare a ADN-ului la vertebrate este foarte ridicat, în timp ce la nevertebrate are valori medii. În unele organisme, cum ar fi nematodul Caenorhabditis elegans , 5mC și ADN-metiltransferazele sunt complet absente. Probabil, în aceste cazuri, alte mecanisme joacă rolul metilării ADN-ului [11] .

În cadrul aceluiași organism, nivelul de metilare a ADN-ului poate varia semnificativ în diferite stadii de dezvoltare și în funcție de regiunea genomului. De exemplu, la șoareci , celulele primordiale ale liniei germinale suferă o demetilare la nivelul întregului genom, dar în stadiul de implantare a embrionului , semnele de metil revin la pozițiile în care au fost prezente în celulele somatice [11] . Când metilarea ADN-ului afectează regiunea promotor , transcripția genei corespunzătoare este suprimată. În schimb, genele exprimate activ tind să aibă promotori nemetilați [3] .

Mecanismul de reprimare a expresiei genelor prin metilarea ADN-ului include mai multe etape. Diferite proteine ​​care leagă ADN-ul interacționează cu resturile de citozină metilate și nemetilate . Prin intermediul acestora, histon deacetilazele sunt atrase de situsuri de 5mC , care declanșează remodelarea cromatinei , în urma căreia ADN-ul devine indisponibil pentru interacțiunea cu componente ale aparatului de transcripție, cum ar fi ARN polimeraza , ceea ce duce la reprimarea eficientă a expresiei genelor [12] .

Modificări ale histonelor

La eucariote, ADN-ul genomic este cuplat la proteine ​​pentru a forma cromatina . Cele mai numeroase proteine ​​de cromatina sunt histonele, pe care este înfășurată dubla helix ADN . Histonele sunt îmbogățite în aminoacizi încărcați pozitiv , ceea ce facilitează legarea lor de coloana vertebrală zahăr- fosfat încărcată negativ ADN-ului prin interacțiuni electrostatice . Principalele unități structurale repetate ale cromatinei - nucleozomii  - sunt un octamer , incluzând două molecule de histone de bază H2A , H2B , H3 și H4 , pe care are lungimea unei catene de ADN de 146 de perechi de baze . rană (p. despre.). Nucleozomii și ADN-ul înfășurați în jurul lor formează o fibrilă de cromatină cu un diametru de 10 nm , care poate suferi o condensare suplimentară [13] [14] .

Gradul de compactare a cromatinei depinde de stadiul ciclului celular și poate fi diferit în diferite părți ale genomului [15] . Gradul de condensare a cromatinei este legat de activitatea sa transcripțională. Cromatina necondensată este mai activă din punct de vedere transcripțional decât cromatina dens, deoarece este mai accesibilă mașinilor de transcripție. Prin urmare, expresia genelor poate fi modulată prin remodelarea cromatinei și reglarea densității sale de împachetare [14] .

Remodelarea cromatinei se realizează prin introducerea de modificări post-translaționale la cozile N-terminale ale histonelor centrale [16] . Setul de modificări ale histonelor dintr-o celulă dată se numește codul histonelor . Există multe tipuri de modificări ale histonelor: acetilare , metilare, fosforilare , ubiquitinilare , SUMOilare , ADP-ribozilare , deaminare și izomerizare proline . Acetilarea, metilarea, fosforilarea și ubiquitinilarea sunt adesea asociate cu activarea expresiei genelor, în timp ce metilarea, ubiquitinilarea, SUMOilarea, deaminarea și izomerizarea prolinei pot duce la reprimarea genei. Trebuie remarcat faptul că unele modificări, cum ar fi metilarea, fosforilarea și ubiquinitizarea, pot afecta activitatea transcripțională a genelor în funcție de reziduurile specifice de aminoacizi ale genomilor modificați. În plus, regiunea modificabilă a genomului contribuie și ea. Astfel, metilarea lizinei 36 a histonei H3 (H3K36me) în regiunea codificatoare a genei duce la activarea acesteia, în timp ce în promotor, dimpotrivă, la inactivare [14] .

Modificările histonelor afectează expresia genelor prin două mecanisme principale: prin distrugerea contactelor dintre nucleozomi și prin recrutarea ATPazelor care remodelează cromatina. Primul mecanism este realizat prin acetilarea reziduurilor de lizină de pe cozile histonelor, care este catalizată de histon acetiltransferaze . Histone acetiltransferazele fac parte din complexele multiproteice care sunt recrutate la cromatină la legarea de ADN-ul proteinelor activatoare. Acetilarea neutralizează sarcina pozitivă a reziduului de lizină, care stabilizează interacțiunea nucleozomilor cu coloana vertebrală ADN încărcată negativ. Resturile de lizină acetilate din histone promovează disocierea nucleozomilor și decompactarea cromatinei. În cromatina decompactată, ADN-ul este mai accesibil aparatului de transcripție, astfel încât gena devine mai activă. Deacetilazele pot elimina grupările acetil din cozile histonelor [14] [16] .

Al doilea mecanism implică recrutarea complexelor de remodelare a cromatinei prin legarea proteinelor activatoare de amplificatorii respectivi . Complecșii de remodelare a cromatinei modifică poziția nucleozomilor în mai multe moduri, care pot fie să crească, fie să scadă disponibilitatea ADN-ului pentru mașina de transcripție. Un exemplu de complex de remodelare a cromatinei este complexul de drojdie SWI/SNF ; reglează expresia mai multor gene prin rearanjamente ale cromatinei [14] [17] .

Metode

Scopul epigenomicii este de a căuta și de a descrie mărcile epigenetice la nivel global, la fel cum genomica studiază totalitatea materialului genetic al unei celule, iar proteomica studiază totalitatea tuturor proteinelor celulare [1] . Ca și genomica și proteomica, cea mai importantă parte metodologică a epigenomicii este abordările bioinformatice [18] .

Analiza modificărilor histonelor

Procesele de transcripție, replicare și reparare a ADN-ului necesită interacțiunea ADN-ului genomic cu proteinele nucleare . Se știe că unele regiuni ale genomului sunt deosebit de sensibile la acțiunea ADNazei I , care scindează nespecific ADN-ul care nu este protejat de proteine. Astfel de situsuri hipersensibile au fost considerate a fi regiuni active din punct de vedere transcripțional ale genomului, ceea ce a fost confirmat de asocierea lor cu ARN polimeraza, precum și topoizomerazele I și II [19] . În locurile hipersensibile, densitatea de împachetare a ADN-ului este redusă. Cel mai adesea, situsurile hipersensibile corespund promotorilor în care ADN-ul trebuie să fie deschis, astfel încât componentele mașinii transcripționale să se poată lega de el [20] .

O căutare la nivel de genom pentru modificări epigenetice a fost efectuată mai întâi folosind metoda Chromatin immunoprecipitation ( English  Chromatin immunoprecipitation, ChIP ) împreună cu microarrays ADN (această tehnologie este cunoscută sub numele de ChIP-on-chip ) [13] . În cazul ChIP-on-chip , histonele modificate, mai degrabă decât factorii de transcripție și proteinele activatoare de legare la ADN, sunt izolate prin imunoprecipitarea cromatinei. În primul rând, histonele sunt legate covalent de ADN in vivo prin tratarea celulelor cu formaldehidă . Apoi, celulele sunt supuse lizei , ceea ce permite extracția și fragmentarea cromatinei. Fragmentarea cromatinei este efectuată utilizând endonucleaza de restricție sau sonicare . În cursul acestui tratament, regiunile cromatinei care nu sunt asociate cu proteinele sunt distruse, astfel încât să rămână doar complexele ADN-proteină. În plus, cu ajutorul anticorpilor specifici histonelor cu anumite modificări, se realizează imunoprecipitarea complexelor ADN cu astfel de histone [14] . După imunoprecipitare, ADN-ul și histonele sunt separate, fragmentele de ADN sunt amplificate prin reacția în lanț a polimerazei și marcate cu o etichetă fluorescentă (de exemplu , Cy3 sau Cy5). În etapa finală , ADN-ul marcat fluorescent este hibridizat cu fragmente de ADN genomic imobilizate pe o micromatrice ADN. După intensitatea semnalului corespunzător fiecărui fragment, se concluzionează care dintre ele interacționează cu histonele cu marca epigenetică de interes [21] [22] .

Folosind ChIP-on-chip, a fost studiat epigenomul drojdiei de brutărie , pe baza căruia s-au tras concluzii cu privire la funcțiile anumitor modificări ale histonelor. S-a arătat ce semne epigenetice sunt asociate cu reprimarea sau activarea transcripției și în ce părți ale genomului apar. Deși ChIP-on-chip a fost capabil să studieze epigenomul de drojdie cu o acoperire aproape completă, aplicarea sa la organisme cu genom mai mari, cum ar fi oamenii , este limitată [13] [14] .

Pentru un studiu la nivelul întregului genom al semnelor epigenetice pe genomuri mari, împreună cu imunoprecipitarea cromatinei, sunt utilizate metode cu randament ridicat, cum ar fi SAGE (din engleză.  Serial Analysis of Gene Expression ), secvențierea la capăt perechi (PET din engleza.  Etichetă cu sfârșit împerecheat ) și secvențiere cu randament ridicat (această metodă este cunoscută sub numele de ChIP-seq ). ChIP-seq include un protocol standard pentru imunoprecipitarea cromatinei, dar în loc să amplifice ADN-ul izolat și să-l hibridizeze pe o microarray, este secvențiat utilizând metode cu randament ridicat. ChIP-seq s-a dovedit a fi o metodă eficientă pentru analiza modificărilor histonelor la nivel global, identificând locurile de legare pentru proteinele care interacționează cu ADN-ul și cu o rezoluție mai mare decât oferă alte metode [13] [21] .

Analiza metilării ADN-ului

Metodele de determinare a secvenței de nucleotide a ADN-ului nu sunt adecvate pentru detectarea nucleotidelor metilate din aceasta. În special, în timpul reacției în lanț a polimerazei (PCR) sau clonării bacteriene , mărcile de metil nu sunt păstrate în timpul duplicării ADN și se pierde informațiile epigenetice. Metodele de hibridizare a ADN-ului care folosesc sonde radioactive pentru a determina secvența fragmentelor de ADN studiate și poziția lor în genom nu sunt, de asemenea, potrivite, deoarece nu fac distincție între ADN metilat și nemetilat [23] [3] .

Prima metodă dezvoltată pentru detectarea nucleotidelor metilate se bazează pe utilizarea endonucleazelor de restricție (enzime de restricție). În această metodă, ADN-ul genomic este tratat cu două enzime de restricție care recunosc aceeași secvență, dar una dintre ele este sensibilă la metilare, iar cealaltă nu. Ideea metodei este că locul metilat poate fi recunoscut și tăiat numai de o enzimă de restricție care nu este sensibilă la metilare. Comparând fragmentele obținute prin prelucrarea ADN-ului cu o enzimă de restricție sensibilă la metilare și insensibilă la aceasta, este posibil să se identifice situsurile supuse metilării. Această etapă include amplificarea fragmentelor obținute ca urmare a tratamentului cu enzime de restricție prin PCR, separarea lor prin electroforeză pe gel și analiza prin Southern blot [23] [3] .

Metoda descrisă mai sus a fost utilizată pentru a analiza metilarea ADN-ului la locusul hemoglobinei umane . Diverse gene ale acestui locus (γ-, δ- și β-globine) sunt exprimate în diferite stadii de dezvoltare a organismului [24] . Studiul a confirmat că acele gene care nu au fost exprimate au fost îmbogățite în 5mC [25] .

Metoda bazată pe utilizarea restrictazelor nu permite studierea metilării la nivelul întregului genom, adică metilom. Chiar și în cadrul locusului, nu oferă o imagine completă a numărului și locației semnelor de metil, deoarece informațiile despre metilare pot fi obținute numai din acele regiuni care conțin locuri de recunoaștere pentru enzimele de restricție utilizate. În acest sens, metoda dă un număr mare de rezultate fals negative [3] .

Pentru prima dată, metilarea la nivelul genomului a fost studiată folosind o metodă cunoscută sub numele de Restriction landmark genomic scanning (RLGS, literalmente „scanarea genomului pentru locuri de restricție”). Această metodă utilizează, de asemenea, enzime care scindează ADN-ul și sunt sensibile la metilarea acestuia, cu toate acestea, separarea fragmentelor are loc în timpul electroforezei bidimensionale pe gel , ceea ce face posibilă studierea mai detaliată a locației semnelor de metil [3] .

Cu toate acestea, a devenit posibil să se obțină o înțelegere completă de înaltă rezoluție a metilării ADN-ului genomic doar odată cu apariția micromatricelor ADN și a metodelor de secvențiere de generație următoare [26] . Ca și în cazul RLGS, noile abordări implică scindarea ADN-ului cu endonucleaze. În cazul hibridizării cu metilare diferențială  (DMH ), o probă de ADN genomic este procesată de enzime de restricție sensibile la metilare, iar cealaltă de enzime insensibile la metilare. În continuare, fragmentele ambelor probe sunt amplificate și etichetate cu diferite etichete fluorescente , după care fragmentele din ambele probe sunt aplicate pe un microcip. Nivelul de metilare a ADN-ului la un loc dat este determinat ca diferența dintre intensitatea relativă a luminiscenței a doi coloranți. Utilizarea secvențierii cu randament ridicat permite obținerea unei rezoluții mai mari decât utilizarea micromatricelor ADN. Microarray-ul pentru această metodă trebuie să fie normalizat în funcție de densitatea insulelor CpG pentru a oferi rezultate fiabile. În special, secvențierea poate dezvălui metilarea specifică alelei ; în plus, această abordare permite lucrul cu genomi mai mari și nu necesită crearea de microarrays normalizate [3] .

Secvențierea bisulfiților implică transformarea chimică a reziduurilor de citozină nemetilate, astfel încât acestea pot fi identificate în continuare folosind secvențierea convențională. Când este tratată cu bisulfit de sodiu și alcali , citozina nemetilată este transformată în uracil , iar citozina metilată rămâne intactă. Amplificarea și secvențierea ulterioară a ADN-ului netratat cu bisulfit de sodiu și a ADN-ului tratat permite identificarea situsurilor de metilare. La fel ca metodele clasice bazate pe utilizarea restrictazelor sensibile la metilare, secvențierea bisulfiților a fost folosită pentru a studia metilarea în loci individuali, dar apariția metodelor de secvențiere a întregului genom a făcut posibilă utilizarea acesteia pentru a analiza metilarea la nivel de genom. Cu toate acestea, spre deosebire de metodele bazate pe utilizarea restrictazelor, secvențierea bisulfiților face posibilă identificarea situsului de metilare cu o precizie de o nucleotidă. Limitările metodei bisulfit includ conversia incompletă a citozinei metilate în uracil, ceea ce duce la rezultate fals pozitive. În plus, degradarea ADN-ului poate avea loc în timpul secvențierii bisulfitului, iar protocolul metodei include etapa de îndepărtare a bisulfitului de sodiu [23] [3] .

Pentru analiza de metilare la nivelul întregului genom asociată cu secvențierea bisulfiților, sunt utilizate tehnologii de secvențiere de ultimă generație. Combinația acestor metode face posibilă identificarea situsurilor de metilare cu cea mai mare metilare posibilă; cu toate acestea, apar multe dificultăți în etapa de asamblare a citirilor în genom, datorită complexității reduse a secvenței de ADN tratată cu bisulfit. Pentru a combate acest efect, puteți mări lungimea citirilor; Secvențierea bisulfitului de pușcă a genomului întreg (WGBS ) se bazează pe această abordare .  Metoda WGBS folosind platforma Illumina Genome Analyzer a fost deja aplicată pentru a analiza metilomul Arabidopsis thaliana [3] . Există, de asemenea, opțiuni de reprezentare limitate pentru secvențierea bisulfiților [27] [28] care sunt deosebit de relevante în cazul organismelor cu genom mari [29] .

Analiza accesibilității cromatinei

Accesibilitatea cromatinei este înțeleasă ca o măsură a măsurii în care regiunea corespunzătoare a genomului este deschisă pentru interacțiunea cu factorii de transcripție și alte componente ale aparatului de transcripție. Regiunile inaccesibile, pline dens cu nucleozomi, nu suferă transcripție activă, spre deosebire de regiunile deschise [30] . Schimbările în disponibilitatea cromatinei sunt un proces de reglare epigenetic important care realizează niveluri specifice contextului sau specifice celulei de exprimare a anumitor gene [31] . Pentru a studia disponibilitatea cromatinei într-o celulă, sunt utilizate diferite metode, cum ar fi MNase-seq , DNase-seq , ATAC-seq și FAIRE-seq . O caracteristică cheie a acestor abordări este capacitatea lor de a separa ADN-ul legat de histonă de ADN-ul liber. Aceste secvențe sunt apoi aliniate la genomul de referință , ceea ce permite determinarea locației lor [32] .

MNase-seq și DNase-seq se bazează pe același principiu, și anume, scindarea nuclează a ADN-ului liber care nu este legat de histone sau alte proteine. În același timp, fragmentele de ADN care interacționează cu proteinele rămân intacte, astfel încât să poată fi separate de proteine ​​și analizate în continuare. Deoarece aceste metode implică distrugerea regiunilor active ale genomului, poziția lor poate fi stabilită doar indirect prin secvențierea fragmentelor de ADN supraviețuitoare și alinierea lor la genomul de referință. Metoda MNase-seq folosește o nuclează micrococică care introduce o singură ruptură în catena complementară secvenței țintă [33] . Metoda DNase-seq folosește DNaza I, care introduce nespecific rupturi dublu-catenar în ADN [34] . DNase-seq a devenit atât de răspândit încât situsurile fără nucleozomi au fost denumite DHS ( Nase  I hypersensitive site ) [35] , iar consorțiul ENCODE a ales această metodă pentru analiza la nivelul genomului a accesibilității cromatinei [36] . Principala problemă cu DNase-seq este că pauzele pot fi introduse non-aleatoriu, ceea ce reduce calitatea rezultatelor [37] .

Metoda  FAIRE-seq ( Izolarea elementelor de reglementare asistată de formaldehidă ) începe cu legarea încrucișată a ADN-ului cu nucleozomi și scindarea ulterioară a ADN-ului folosind ultrasunete. Fragmentele libere și legate sunt izolate folosind extracția standard fenol - cloroform , în timp ce fracția proteică formează o interfază vâscoasă, iar ADN-ul liber este în fază apoasă, de unde poate fi luat pentru analiză ulterioară [38] . Sonicarea introduce pauze aleatorii, astfel încât factorul non-aleatoriu este complet exclus aici, iar fragmentele obținute după sonicare sunt mai lungi decât în ​​cazul tratamentului enzimatic (200-700 bp) [32] . Datorită acestui fapt, FAIRE-seq poate fi utilizat pentru a analiza secțiuni mari ale genomului, dar nu oferă o rezoluție a unui nucleozom. Spre deosebire de metodele care utilizează nucleaze, FAIRE-seq face posibilă identificarea directă a regiunilor active ale genomului și include o etapă mai simplă de pregătire a probei [39] .

Metoda ATAC-seq se bazează pe utilizarea transpozazei Tn5 . Transposaza inserează adaptoare în genom pentru secvențiere și cu o frecvență mai mare în acele regiuni ale genomului care sunt lipsite de proteine. Adaptorii inserați cu transpozază sunt utilizați în continuare în PCR și secvențierea ulterioară [40] .

Detectarea directă a semnelor epigenetice

Sensibilitatea ADN polimerazei , utilizată în secvențierea în timp real cu o singură moleculă , face posibilă detectarea directă a mărcilor epigenetice, cum ar fi grupările metil, pe măsură ce polimeraza se mișcă de-a lungul moleculei de ADN care este secvențiată [41] . Mai multe proiecte au arătat aplicabilitatea acestei abordări pentru obținerea de informații epigenetice la nivelul întregului genom în bacterii [42] [43] [44] [45] .

Secvențierea nanoporilor se bazează pe detectarea schimbărilor în puterea curentului electric la întâlnirea cu nucleotide modificate (de exemplu, cele metilate). ADN-polimeraza asigură încărcarea ADN-ului monocatenar în porul unei camere miniaturale umplute cu o soluție de electrolit , în care este generat un curent electric datorită tensiunii aplicate. Trecerea anumitor nucleotide printr-un por reduce secțiunea transversală disponibilă pentru ionii electroliți , ceea ce duce la scăderea puterii curentului [46] . Înregistrând astfel de modificări ale puterii curente, este posibil să se identifice insulele CpG în ADN-ul trecut prin por. Secvențierea nanoporilor poate chiar distinge între hidroximetilare și metilare. Sequencerul MinION, dezvoltat de Oxford Nanopore Technologies , face posibilă distingerea citozinei nemetilate de cele metilate fără tratament chimic prealabil [47] . Tehnologia de secvențiere Nanopore este implementată și în dispozitivele Nanopolish și SignaAlign: primul permite estimarea frecvenței de metilare în citiri , iar al doilea, probabilitatea acesteia [48] .

Secvențierea în timp real cu o singură moleculă implică utilizarea ghid de undă în modul zero . O singură moleculă de ADN polimerază este conectată la partea inferioară a fibrei, șablonul pentru care este, de asemenea, o singură moleculă de ADN. Fiecare dintre cele patru nucleotide ADN este marcată cu unul dintre cei patru coloranți fluorescenți diferiți. Când ADN polimeraza adaugă o altă nucleotidă, o etichetă fluorescentă este îndepărtată de pe aceasta, iar semnalul său luminos este înregistrat de un detector. Când ADN polimeraza întâlnește o nucleotidă modificată în șablon în timpul secvențierii, cinetica acesteia se schimbă: accelerează sau încetinește într-un mod unic pentru modificarea respectivă. În timpul secvențierii, blițurile fluorescente sunt evaluate nu numai după spectrele lor de emisie , ci și după durata și intervalele dintre blițuri. Acești parametri, cunoscuți ca lățimea impulsului și intervalul între impulsuri, fac posibilă evaluarea cineticii ADN polimerazei la un moment dat în timp. Lățimea pulsului este o funcție a tuturor etapelor cinetice de la atașarea nucleotidelor până la eliberarea fluoroforului, iar intervalul interpuls este determinat de cinetica legării nucleotidelor și translocarea ADN polimerazei. În 2010, s-a demonstrat că secvențierea în timp real cu o singură moleculă detectează nucleotide modificate, cum ar fi N 6 -metiladenozină , 5-metilcitozină și 5-hidroxilcitozină. Aceste modificări modifică cinetica ADN polimerazei în moduri diferite, ceea ce face posibilă distingerea lor una de alta [49] .  

În 2017, a fost propusă o metodă combinată, inclusiv conversia bisulfitului a reziduurilor de citozină nemetilate și secvențierea în timp real a unei singure molecule. Această abordare este cunoscută sub denumirea de secvențiere a bisulfitului în timp real cu o singură moleculă (SMRT-BS ) și este o metodă pentru analiza țintită a metilării insulei CpG [ 50] . 

Modele teoretice

Primele modele matematice pentru diferite stări de nucleozom care afectează expresia genelor au fost propuse în anii 1980. Ulterior, aceste idei au fost aproape complet uitate până când au apărut date experimentale privind modificările covalente ale histonelor și codul histonelor [51] . Ulterior, metodele cu randament ridicat au arătat o distribuție largă a modificărilor epigenetice, care au contribuit la dezvoltarea de noi modele teoretice care descriu aspectul, menținerea și schimbarea acestor mărci [52] . Majoritatea modelelor propuse descriu modificări epigenetice în termenii unei rețele unidimensionale [53] .

Editarea epigenomului

Există multe metode de cercetare care vizează editarea epigenomului. Modificări ale epigenomului apar, de asemenea, în experimentele genetice clasice, ducând la knockout sau knockdown a genei țintă, ștergerea domeniilor proteice , apariția mutațiilor punctuale , mutații de achiziție sau pierderea funcției. Epigenomul este, de asemenea, afectat de introducerea de secvențe artificiale cu expresie inductibilă în genom , precum și de introducerea de vectori exprimați ectopic în celulă . Epigenomul poate fi modificat de molecule mici biologic active care inhibă enzimele care sunt responsabile pentru încorporarea sau îndepărtarea semnelor epigenetice. Exemple sunt azacitidina și decitabina , care inhibă ireversibil ADN metiltransferazele 1 și 3, precum și romidepsina , care inhibă histon deacetilaza. Editarea țintită a epigenomului implică aplicarea tehnicilor de editare țintită a genomului care utilizează nucleaze cu degete de zinc , nucleaze TALEN , precum și sistemul CRISPR / Cas9 . Efectul de editare este asociat cu efectul asupra enzimelor care sunt implicate direct sau indirect în îndepărtarea sau introducerea semnelor epigenetice [9] .

Istorie

Termenul „epigenetică” a fost folosit pentru prima dată de Conrad Hal Waddington în 1942 pentru a se referi la mecanismele moleculare care determină expresia fenotipică a unei gene. În următorii 50 de ani, aceste mecanisme au fost studiate cu atenție, iar influența lor în asigurarea plasticității celulelor individuale și a organismului în ansamblu a fost demonstrată [54] .

Termenul de epigenomică a fost propus în 1997 [55] , când dezvoltarea metodelor de mare performanță a făcut posibilă studierea modificărilor epigenetice la nivel de genom. În anii 2000, au început lucrările de cartografiere a epigenomului uman ( Proiectul Epigenomului uman în engleză  ) [56] . În 2003, a fost lansat proiectul ENCODE , care a devenit primul proiect internațional care a folosit date epigenomice pentru a căuta elemente de reglementare în genomul uman. În 2010, a fost fondat Consorțiul Internațional de Epigenom Uman (IHEC) cu scopul de a obține 1000 de epigenomi de referință de diferite tipuri de celule [54] .  

Note

  1. ↑ 12 Russell , 2010 , p. 217, 230.
  2. ↑ 12 Russell , 2010 , p. 475.
  3. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Laird PW Principiile și provocările analizei de metilare a ADN-ului la nivel de genom.  (engleză)  // Nature Reviews. genetica. - 2010. - martie ( vol. 11 , nr. 3 ). - P. 191-203 . - doi : 10.1038/nrg2732 . — PMID 20125086 .
  4. ↑ 1 2 Zhu J. , Adli M. , Zou JY , Verstappen G. , Coyne M. , Zhang X. , Durham T. , Miri M. , Deshpande V. , De Jager PL , Bennett DA , Houmard JA , Muoio DM . , Onder TT , Camahort R. , Cowan CA , Meissner A. , ​​Epstein CB , Shoresh N. , Bernstein BE Tranziții ale stării cromatinei la nivelul genomului asociate cu indicii de dezvoltare și de mediu.  (engleză)  // Cell. - 2013. - 31 ianuarie ( vol. 152 , nr. 3 ). - P. 642-654 . - doi : 10.1016/j.cell.2012.12.033 . — PMID 23333102 .
  5. ↑ Alabert C. , Groth A. Replicarea cromatinei și întreținerea epigenomului.  (engleză)  // Nature Reviews. Biologie celulară moleculară. - 2012. - 23 februarie ( vol. 13 , nr. 3 ). - P. 153-167 . - doi : 10.1038/nrm3288 . — PMID 22358331 .
  6. ↑ Ghosh S. , Sinha JK , Raghunath M. Întreținerea epigenomică prin intervenție alimentară poate facilita procesul de reparare a ADN-ului pentru a încetini progresul îmbătrânirii premature.  (Engleză)  // IUBMB Life. - 2016. - Septembrie ( vol. 68 , nr. 9 ). - P. 717-721 . - doi : 10.1002/iub.1532 . — PMID 27364681 .
  7. ↑ The Potential Epigenetic and Anticancer Power of Dietary Flavones (11 octombrie 2016).
  8. ↑ Russell, 2010 , p. 597.
  9. ↑ 1 2 Holtzman L. , Gersbach CA Editarea epigenomului: remodelarea peisajului genomic.  (Engleză)  // Revizuirea anuală a genomicii și a geneticii umane. - 2018. - 31 august ( vol. 19 ). - P. 43-71 . - doi : 10.1146/annurev-genom-083117-021632 . — PMID 29852072 .
  10. ↑ Russell, 2010 , p. 531-532.
  11. ↑ 1 2 Pasărea A. Modele de metilare ADN și memorie epigenetică.  (engleză)  // Genes & Development. - 2002. - 1 ianuarie ( vol. 16 , nr. 1 ). - P. 6-21 . - doi : 10.1101/gad.947102 . — PMID 11782440 .
  12. ↑ Russell, 2010 , p. 532-533.
  13. ↑ 1 2 3 4 Barski A. , Cuddapah S. , Cui K. , Roh TY , Schones DE , Wang Z. , Wei G. , Chepelev I. , Zhao K. High-resolution profile of hisstone methylations in the human genome.  (engleză)  // Cell. - 2007. - Vol. 129, nr. 4 . - P. 823-837. - doi : 10.1016/j.cell.2007.05.009 . — PMID 17512414 .
  14. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Kouzarides T. Modificări ale cromatinei și funcția lor.  (engleză)  // Cell. - 2007. - 23 februarie ( vol. 128 , nr. 4 ). - P. 693-705 . - doi : 10.1016/j.cell.2007.02.005 . — PMID 17320507 .
  15. ↑ Russell, 2010 , p. 24-27.
  16. ↑ 12 Russell , 2010 , p. 529-530.
  17. ↑ Russell, 2010 , p. 530.
  18. ↑ Russell, 2010 , p. 218.
  19. ↑ Gross DS , Garrard WT Situri de hipersensibilitate la nuclează în cromatina.  (Engleză)  // Revizuirea anuală a biochimiei. - 1988. - Vol. 57 . - P. 159-197 . - doi : 10.1146/annurev.bi.57.070188.001111 . — PMID 3052270 .
  20. ↑ Russell, 2010 , p. 529.
  21. ↑ 12 Gibson , Muse, 2009 , p. 229-232.
  22. ↑ Russell, 2010 , p. 532.
  23. ↑ 1 2 3 Eads CA , Danenberg KD , Kawakami K. , Saltz LB , Blake C. , Shibata D. , Danenberg PV , Laird PW MethyLight: un test de mare debit pentru a măsura metilarea ADN-ului.  (engleză)  // Cercetarea acizilor nucleici. - 2000. - Vol. 28, nr. 8 . - P. 32. - PMID 10734209 .
  24. ↑ Russell, 2010 , p. 552-553.
  25. ↑ van der Ploeg LH , Metilarea ADN-ului Flavell RA în locusul beta-globinei gamma delta umană în țesuturile eritroide și noneritroide. (engleză)  // Cell. - 1980. - Aprilie ( vol. 19 , nr. 4 ). - P. 947-958 . - doi : 10.1016/0092-8674(80)90086-0 . — PMID 6247075 .
  26. ↑ Johannes F. , Colot V. , Jansen RC Dinamica epigenomului: o perspectivă genetică cantitativă.  (engleză)  // Nature Reviews. genetica. - 2008. - noiembrie ( vol. 9 , nr. 11 ). - P. 883-890 . doi : 10.1038 / nrg2467 . — PMID 18927581 .
  27. ↑ Trucchi E. , Mazzarella AB , Gilfillan GD , Lorenzo MT , Schönswetter P. , Paun O. BsRADseq: screening DNA methylation in natural populations of non-model species.  (engleză)  // Ecologie moleculară. - 2016. - Aprilie ( vol. 25 , nr. 8 ). - P. 1697-1713 . - doi : 10.1111/mec.13550 . — PMID 26818626 .
  28. ↑ van Gurp TP , Wagemaker NC , Wouters B. , Vergeer P. , Ouborg JN , Verhoeven KJ epiGBS: reprezentare redusă fără referință a secvențierii bisulfiților.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2016. - Aprilie ( vol. 13 , nr. 4 ). - P. 322-324 . - doi : 10.1038/nmeth.3763 ​​​​. — PMID 26855363 .
  29. ^ Paun O. , Verhoeven KJF , Richards CL Oportunități și limitări ale reprezentării reduse a secvențierii bisulfiților în epigenomica ecologică a plantelor. (engleză)  // Noul fitolog. - 2019. - ianuarie ( vol. 221 , nr. 2 ). - P. 738-742 . - doi : 10.1111/nph.15388 . — PMID 30121954 .  
  30. ↑ Kundaje A. , Meuleman W. , Ernst J. , Bilenky M. , Yen A. , Heravi-Moussavi A. , Kheradpour P. , Zhang Z. , Wang J. , Ziller MJ , Amin V. , Whitaker JW , Schultz MD , Ward LD , Sarkar A. , Quon G. , Sandstrom RS , Eaton ML , Wu YC , Pfenning AR , Wang X. , Claussnitzer M. , Liu Y. , Coarfa C. , Harris RA , Shoresh N. , Epstein CB , Gjoneska E. , Leung D. , Xie W. , Hawkins RD , Lister R. , Hong C. , Gascard P. , Mungall AJ , Moore R. , Chuah E. , Tam A. , Canfield TK , Hansen RS , Kaul R. , Sabo PJ , Bansal MS , Carles A. , Dixon JR , Farh KH , Feizi S. , Karlic R. , Kim AR , Kulkarni A. , Li D. , Lowdon R. , Elliott G. , Mercer TR , Neph SJ , Onuchic V. , Polak P. , Rajagopal N. , Ray P. , Sallari RC , Siebenthall KT , Sinnott-Armstrong NA , Stevens M. , Thurman RE , Wu J. , Zhang B. , Zhou X. , Beaudet AE , Boyer LA , De Jager PL , Farnham PJ , Fisher SJ , Haussler D. , Jones SJ , Li W. , Marra MA , McManus MT , Sunyaev S. , Thomson JA , Tlsty TD , Tsai LH , Wang W. , Waterland RA , Zhang MQ , Chadwick LH , Bernstein BE , Costello JF , Ecker JR , Hirst M. , Meissner A. , Milosavljevic A. , Ren B. , Stamatoyannopoulos JA , Wang T. , Kellis M. Analiza integrativă a 111 epigenomi umani de referință.  (engleză)  // Natură. - 2015. - 19 februarie ( vol. 518 , nr. 7539 ). - P. 317-330 . - doi : 10.1038/nature14248 . — PMID 25693563 .
  31. ↑ Pennacchio L.A. , Bickmore W. , Dean A. , Nobrega M.A. , Bejerano G. Enhancers: five essential questions.  (engleză)  // Nature Reviews. genetica. - 2013. - Aprilie ( vol. 14 , nr. 4 ). - P. 288-295 . doi : 10.1038 / nrg3458 . — PMID 23503198 .
  32. ↑ 1 2 Zhang Z. , Pugh BF Cartografierea la nivel de genom de înaltă rezoluție a structurii primare a cromatinei.  (engleză)  // Cell. - 2011. - 21 ianuarie ( vol. 144 , nr. 2 ). - P. 175-186 . - doi : 10.1016/j.cell.2011.01.003 . — PMID 21241889 .
  33. ↑ Axel R. Clivajul ADN-ului în nuclee și cromatina cu nuclează stafilococică.  (engleză)  // Biochimie. - 1975. - iulie ( vol. 14 , nr. 13 ). - P. 2921-2925 . - doi : 10.1021/bi00684a020 . — PMID 1148185 .
  34. ↑ Deoxiribonucleaza I (2013). Data accesului: 26 noiembrie 2018.
  35. ^ Zhou W. , Sherwood B. , Ji Z. , Xue Y. , Du F. , Bai J. , Ying M. , Ji H. Predicția la nivel de genom a hipersensibilității ADNazei I folosind expresia genelor.  (engleză)  // Nature Communications. - 2017. - 19 octombrie ( vol. 8 , nr. 1 ). - P. 1038-1038 . - doi : 10.1038/s41467-017-01188-x . — PMID 29051481 .
  36. ↑ O enciclopedie integrată a elementelor ADN din genomul uman.  (engleză)  // Natură. - 2012. - Vol. 489, nr. 7414 . - P. 57-74. - doi : 10.1038/nature11247 . — PMID 22955616 .
  37. ↑ He HH , Meyer CA , Hu SS , Chen MW , Zang C. , Liu Y. , Rao PK , Fei T. , Xu H. , Long H. , Liu XS , Brown M. Protocolul rafinat DNase-seq și analiza datelor dezvăluie părtinire intrinsecă în identificarea amprentei factorului de transcripție.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2014. - ianuarie ( vol. 11 , nr. 1 ). - P. 73-78 . - doi : 10.1038/nmeth.2762 . — PMID 24317252 .
  38. ↑ Tsompana M. , Buck MJ Chromatin accessibility: a window into the genom.  (engleză)  // Epigenetică și cromatina. - 2014. - Vol. 7 , nr. 1 . — P. 33 . - doi : 10.1186/1756-8935-7-33 . — PMID 25473421 .
  39. ↑ Giresi PG , Kim J. , McDaniell RM , Iyer VR , Lieb JD FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) izolează elementele de reglare active din cromatina umană.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2007. - Vol. 17, nr. 6 . - P. 877-885. - doi : 10.1101/gr.5533506 . — PMID 17179217 .
  40. ↑ Buenrostro JD , Giresi PG , Zaba LC , Chang HY , Greenleaf WJ Transpunerea cromatinei native pentru profilarea epigenomică rapidă și sensibilă a cromatinei deschise, a proteinelor de legare la ADN și a poziției nucleozomului.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2013. - Decembrie ( vol. 10 , nr. 12 ). - P. 1213-1218 . - doi : 10.1038/nmeth.2688 . — PMID 24097267 .
  41. ↑ Schadt EE , Banerjee O. , Fang G. , Feng Z. , Wong WH , Zhang X. , Kislyuk A. , Clark TA , Luong K. , Keren-Paz A. , Chess A. , Kumar V. , Chen- Plotkin A. , Sondheimer N. , Korlach J. , Kasarskis A. Modelarea variației vitezei cinetice în datele de secvențiere ADN de a treia generație pentru a detecta modificări presupuse la bazele ADN.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 2013. - ianuarie ( vol. 23 , nr. 1 ). - P. 129-141 . - doi : 10.1101/gr.136739.111 . — PMID 23093720 .
  42. ^ Davis BM , Chao MC , Waldor MK Intrarea în era epigenomică bacteriană cu secvențierea ADN-ului în timp real cu o singură moleculă. (Engleză)  // Opinia curentă în microbiologie. - 2013. - Aprilie ( vol. 16 , nr. 2 ). - P. 192-198 . - doi : 10.1016/j.mib.2013.01.011 . — PMID 23434113 .  
  43. ^ Lluch-Senar M. , Luong K. , Lloréns -Rico V. , Delgado J. , Fang G. , Spittle K. , Clark TA , Schadt E. , Turner SW , Korlach J. , Serrano L. Comprehensive methylome characterization of Mycoplasma genitalium și Mycoplasma pneumoniae la rezoluție cu o singură bază. (Engleză)  // PLoS Genetics. - 2013. - Vol. 9 , nr. 1 . - P. e1003191-1003191 . - doi : 10.1371/journal.pgen.1003191 . — PMID 23300489 .  
  44. ↑ Murray IA , Clark TA , Morgan RD , Boitano M. , Anton BP , Luong K. , Fomenkov A. , Turner SW , Korlach J. , Roberts RJ The methylomes of six bacteris.  (engleză)  // Cercetarea acizilor nucleici. - 2012. - Vol. 40, nr. 22 . - P. 11450-11462. - doi : 10.1093/nar/gks891 . — PMID 23034806 .
  45. ^ Fang G. , Munera D. , Friedman DI , Mandlik A. , Chao MC , Banerjee O. , Feng Z. , Losic B. , Mahajan MC , Jabado OJ , Deikus G. , Clark TA , Luong K. , Murray IA , Davis BM , Keren-Paz A. , Chess A. , Roberts RJ , Korlach J. , Turner SW , Kumar V. , Waldor MK , Schadt EE Cartografierea la nivel de genom a reziduurilor de adenină metilate în Escherichia coli patogenă folosind o moleculă reală -secvențierea în timp. (Engleză)  // Nature Biotechnology. - 2012. - Decembrie ( vol. 30 , nr. 12 ). - P. 1232-1239 . - doi : 10.1038/nbt.2432 . — PMID 23138224 .  
  46. ↑ Simpson JT , Workman RE , Zuzarte PC , David M. , Dursi LJ , Timp W. Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2017. - Aprilie ( vol. 14 , nr. 4 ). - P. 407-410 . - doi : 10.1038/nmeth.4184 . — PMID 28218898 .
  47. ↑ Laszlo AH , Derrington IM , Brinkerhoff H. , Langford KW , Nova IC , Samson JM , Bartlett JJ , Pavlenok M. , Gundlach JH Detectarea și maparea 5-metilcitozinei și 5-hidroximetilcitozinei cu nanopori Msp.  (engleză)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America. - 2013. - 19 noiembrie ( vol. 110 , nr. 47 ). - P. 18904-18909 . - doi : 10.1073/pnas.1310240110 . — PMID 24167255 .
  48. ↑ Jain M. , Koren S. , Miga KH , Quick J. , Rand AC , Sasani TA , Tyson JR , Beggs AD , Dilthey AT , Fiddes IT , Malla S. , Marriott H. , Nieto T. , O'Grady J . , Olsen HE , Pedersen BS , Rhie A. , Richardson H. , Quinlan AR , Snutch TP , Tee L. , Paten B. , Phillippy AM , Simpson JT , Loman NJ , Loose M. Nanopore secvențierea și asamblarea unui genom uman cu citiri ultra-lungi.  (Engleză)  // Nature Biotechnology. - 2018. - Aprilie ( vol. 36 , nr. 4 ). - P. 338-345 . - doi : 10.1038/nbt.4060 . — PMID 29431738 .
  49. ↑ Flusberg BA , Webster DR , Lee JH , Travers KJ , Olivares EC , Clark TA , Korlach J. , Turner SW Detectarea directă a metilării ADN-ului în timpul secvențierii în timp real cu o singură moleculă.  (Engleză)  // Metode de natură. - 2010. - iunie ( vol. 7 , nr. 6 ). - P. 461-465 . - doi : 10.1038/nmeth.1459 . — PMID 20453866 .
  50. ↑ Yang Y., Scott SA Profilarea metilării ADN-ului utilizând secvențierea bisulfitului în timp real cu o singură moleculă cu citire lungă (SMRT-BS  ) . - 2017. - Vol. 1654. - P. 125-134. — (Metode în biologie moleculară). - ISBN 978-1-4939-7230-2 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7231-9_8 .
  51. ↑ Strahl BD , Allis CD Limbajul modificărilor histonelor covalente.  (engleză)  // Natură. - 2000. - 6 ianuarie ( vol. 403 , nr. 6765 ). - P. 41-45 . - doi : 10.1038/47412 . — PMID 10638745 .
  52. ^ Dodd IB , Michelen MA , Sneppen K. , Thon G. Theoretical analysis of epigenetic cell memory by nucleosome modification. (engleză)  // Cell. - 2007. - 18 mai ( vol. 129 , nr. 4 ). - P. 813-822 . - doi : 10.1016/j.cell.2007.02.053 . — PMID 17512413 .  
  53. ↑ Teif VB , Rippe K. Statistical-mechanical lattice models for protein-DNA binding in chromatin.  (engleză)  // Journal of Physics. Materie condensată: un jurnal al Institutului de Fizică. - 2010. - 20 octombrie ( vol. 22 , nr. 41 ). — P. 414105 . - doi : 10.1088/0953-8984/22/41/414105 . — PMID 21386588 .
  54. ↑ 1 2 Stricker Stefan H. , Köferle Anna , Beck Stephan. De la profiluri la funcție în epigenomică  //  Nature Reviews Genetics. - 2016. - 21 noiembrie ( vol. 18 , nr. 1 ). - P. 51-66 . — ISSN 1471-0056 . - doi : 10.1038/nrg.2016.138 .
  55. ↑ Merriam Webster: Epigenomics .
  56. ↑ Callinan Pauline A. , Feinberg Andrew P. The emerging science of epigenomics  //  Human Molecular Genetics. - 2006. - 15 aprilie ( vol. 15 , nr. suppl_1 ). - P.R95-R101 . — ISSN 1460-2083 . doi : 10.1093 / hmg/ddl095 .

Literatură

  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii