Cosmide

Cosmide (Cosmides) - plasmide care conțin un fragment de ADN al fagului lambda incluzând cos -secțiunea [1] . Împreună cu sistemele de ambalare pentru particulele fagice in vitro , acestea sunt utilizate ca molecule vectoriale pentru clonarea genelor și în construcția de biblioteci genomice. Cosmidele au fost construite pentru prima dată de Collins și Brüning în 1978 [2] . Numele lor provine de la prescurtarea a doi termeni: cos -section (termenul în sine, la rândul său, provine din engleza co hesive end s  - sticky ends) și plasmid .

Cosmidele pot fi folosite pentru a dona segmente de ADN de 32-47 kb . Plasmide, dacă clonați în ele secțiuni de ADN mai mari de 4-5 kb. devin instabile datorită tendinţei crescânde de recombinare . În plus, cosmidele sunt împachetate în particule de fagi, ceea ce le permite să fie livrate bacteriilor prin transducție .

Plot Cos

Regiunea cos constă din ~ 200 de perechi de baze și este necesară pentru ambalarea cosmida într-o particulă de fag. Conține un situs cosN în care enzima terminaza face o singură ruptură a fiecăreia dintre catenele de ADN la o distanță de 12 pb. unul de altul. Cosmida ciclică se linearizează pentru a forma capete lipicioase de 12 pb. (ADN-ul trebuie să fie liniar pentru a intra în capul fagului). Site -ul cosB deține terminaza în timp ce taie ADN-ul. Situl cosQ de pe următorul cosmid (deoarece replicarea inelului de rulare duce adesea la formarea de concatemeri ) este reținut de terminală după ce cosmida anterioară a fost împachetată. Acest lucru face posibilă protejarea cosmidelor liniare de scindarea de către ADNaze.

Structura cosmidelor

În esență, cosmida este ADN-ul fagului lambda , din care au fost îndepărtate toate genele, cu excepția site-ului cos . Cosmida are o dimensiune de aproximativ 5 kb .și include în mod necesar următoarele elemente: un sit cos necesar pentru ambalarea în virioni fagi lambda , o origine pentru replicare într-o celulă bacteriană sau eucariotă, situsuri de recunoaștere a endonucleazei de restricție și o genă marker (de exemplu, o genă pentru rezistența la orice antibiotic ). ) [3] .

Cosmidele pot fi folosite pentru a dona segmente de ADN de 32-47 kb . Pentru a face acest lucru, cosmida și ADN-ul străin sunt tratate cu aceeași endonuclează de restricție, după care fragmentele liniare rezultate sunt amestecate și se efectuează o reacție de ligatură. Apoi, ADN-ul este împachetat în capete de fagi in vitro , este tăiat în site-uri cos . Proteinele virale necesare sunt obținute din lizat de E. coli cI857 ( roșu - gam - Sam și Dam (cap) și Eam (coadă)). Acest proces este însoțit de selecția fragmentelor în funcție de dimensiune, deoarece numai ADN-ul cu o lungime de 78-105% din genomul fagului lambda poate fi împachetat. Astfel, cosmidele predominant recombinante care conțin o regiune ADN donată vor intra în virioni. Produsele de legare între două cosmide vor fi prea mici pentru ambalare, iar între două fragmente de ADN străin vor fi mari.

Particulele de fagi rezultate cu cosmide recombinante sunt utilizate pentru a infecta celulele E. coli. În citoplasmă, cosmidele sunt ciclizate prin legarea la capătul lipicios și prin acțiunea enzimei ligaze și apoi se replic ca plasmidele obișnuite fără a prezenta nici una dintre proprietățile unui fag lambda. Selecția celulelor transformate este efectuată în funcție de gena marker prezentă în molecula vector.

Modificări

Deoarece cosmidele fac posibilă clonarea secțiunilor relativ mari de ADN, ele sunt vectori convenabil pentru crearea de biblioteci de fragmente de genom eucariote obținute prin digestie parțială cu endonucleaze de restricție . Cu toate acestea, produsele unui astfel de clivaj pot fi de dimensiuni diferite și există cazuri în care două fragmente relativ mici care nu erau adiacente în genom sunt legate și se creează clona corespunzătoare, ceea ce va da o impresie falsă a poziției lor în cromozomi . . Această problemă poate fi depășită prin fracționarea produselor de digestie parțială în funcție de dimensiune. Cu toate acestea, nici măcar această metodă nu evită complet apariția clonelor de cosmide care conțin mai multe fragmente de ADN ligate, așa că au fost propuse și alte metode, în special, defosforilarea fragmentelor de ADN străine, astfel încât acestea să nu se poată combina între ele. De asemenea, au fost creați vectori cosmide speciali pJB8 (Burke și Ish-Horowicz, 1981) și c2XB (Bates și Swift, 1983), folosindu-se de care probabilitatea formării clonelor false este minimizată.

Cosmidele moderne din seriile pWE și sCos sunt caracterizate prin prezența mai multor situsuri de donare înconjurate de promotori de fagi și situsuri unice de recunoaștere prin endonucleazele de restricție Not I, Sac II și Sfi I, care permit unei enzime să taie inserția.

Note

1. ↑ Hohn Barbara, Murray Kenneth. Ambalarea moleculelor de ADN recombinant în particule bacteriofage in vitro   // Proc . Nati. Acad. sci. SUA: jurnal. - 1977. - August ( vol. 74 , nr. 8 ). - P. 3259-3263 . - doi : 10.1073/pnas.74.8.3259 .
2. ↑ Collins John, Hohn Barbara.  Cosmide: un tip de vector de clonare a genelor plasmide care este ambalat in vitro în capete lambda de bacteriofagi  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal. - 1978. - 1 septembrie ( vol. 75 , nr. 9 ). - P. 4242-4246 . - doi : 10.1073/pnas.75.9.4242 .
3. ↑ Cosmide . Phillip McClean. Consultat la 4 aprilie 2014. Arhivat din original pe 26 martie 2014. (nedefinit)

Surse

• Primrose SB, Twyman RM, Old RW Principles of Gene Manipulation  (neopr.) . — al 6-lea. — Wiley-Blackwell , 2002. — ISBN 0632059540 .
• Griffiths AJF, Wessler SR, et al. O introducere în analiza genetică  (neopr.) . — al 8-lea. — W. H. Freeman, 2004. - ISBN 978-0716749394 . Arhivat pe 26 februarie 2015 la Wayback Machine
• Bruce A. Voyles (2002) The biology of viruses 2nd ed. ISBN 0-07-237031-9
• Stryer, Lubert (1995) Biochimie ed. a 4-a. ISBN 0-7167-2009-4
• Colecția Eurekah Biosciences: Viruși, @NCBI

Dicționare și enciclopedii	Britannica (online)