Sinteza oligonucleotidelor

Sinteza oligonucleotidelor  este sinteza chimică a fragmentelor relativ scurte de acizi nucleici cu o structură chimică dată (secvență). Metoda este utilizată în practica modernă de laborator pentru a obține oligonucleotide cu secvența dorită într-un mod rapid și ieftin.

Cea mai comună metodă de sinteza a oligonucleotidelor se bazează pe utilizarea amidofosfiților  , blocuri de construcție care sunt derivați reactivi ai dezoxiribonucleozidelor ( dA , dC , dG , T ) sau ribonucleozidelor ( A , C , G , U ) și permit sinteza fragmente scurte de ADN și respectiv ARN . Sunt, de asemenea, utilizați și alți amidofosfiți, care fac posibilă introducerea nucleozidelor modificate, diferite marcaje și grupări funcționale în lanțul de produs . În timpul sintezei, acești reactivi sunt adăugați pe rând, în ordinea specificată de secvența produsului țintă, la lanțul care crește pe suportul în fază solidă . Acest proces a fost complet automatizat la sfârșitul anilor 1970 și este realizat în prezent în sintetizatoare dedicate controlate de computer.

După terminarea sintezei, oligonucleotida este separată de purtător, grupările protectoare utilizate în timpul sintezei sunt îndepărtate, iar produsul rezultat este purificat prin electroforeză sau HPLC .

Oligonucleotidele sintetice sunt utilizate pe scară largă în biologia moleculară și medicină, de exemplu, ca oligonucleotide antisens , primeri pentru secvențierea și amplificarea ADN-ului , sonde pentru determinarea secvențelor complementare de ADN și ARN, instrumente pentru introducerea țintită a mutațiilor și situsurilor de restricție și pentru sinteza de gene artificiale .

Istorie

În timpul evoluției sintezei oligonucleotidelor, au fost dezvoltate patru metode principale pentru a crea legături între nucleozide . Aceste metode sunt discutate în detaliu în recenzii detaliate ale literaturii [1] [2] [3] .

Lucrările timpurii și metoda modernă a fosfonatului H

La începutul anilor 1950, grupul lui Alexander Todd din Cambridge a pus bazele metodelor H-fosfonat și fosfotriester pentru sinteza oligonucleotidelor [4] [5] prin sintetizarea clorofosfatului protejat 4 , reacționând cu timidina protejată 3' 5 și confirmând structura dinucleotidei 6 protejate rezultată prin clivaj enzimatic. În mod ciudat, nu s-a mai efectuat nicio lucrare în această direcție la Cambridge (Todd a remarcat în autobiografia sa că sinteza oligonucleotidelor nu l-a atras) [1] .

Revenirea la munca lui Todd nu a venit decât treizeci de ani mai târziu, când două grupuri de cercetare au adaptat condensarea H-fosfonatului la sinteza în fază solidă folosind nucleozide H-fosfonați ca blocuri de construcție și clorură de pivaloil, clorură de 2,4,6-triizopropilbenzensulfonil (TIPS- Cl) și alți compuși - ca activatori [6] [7] . În practică, metoda a fost organizată ca un simplu ciclu sintetic format din două etape: îndepărtarea protecției dimetoxitritil și condensare.

Oxidarea legăturii H-fosfonat diester între nucleozide în această metodă se realizează după sinteza lanțului de oligonucleotide sub acțiunea unei soluții de iod în piridină apoasă . Dacă este necesar, oxidarea poate fi efectuată în medii anhidre [8] . Metoda face posibilă, de asemenea, sintetizarea analogilor de tiofosfat [9] și selenofosfat [10] ai oligonucleotidelor. Oxidarea cu tetraclorură de carbon în prezența aminelor primare și secundare conduce la analogi amidofosfat [11] [12] .

De regulă, gruparea 5’-hidroxil din toți 3’-H-fosfonații nucleozidelor și gruparea amino din H-fosfonații nucleozidelor cu bazele A, G și C sunt protejate înainte de utilizare în sinteză de aceleași grupări ca și în metoda amidofosfitului . Cu toate acestea, protecția grupărilor amino nu este strict necesară [8] [13] .

Metoda fosfodiesterului

În anii 1950, Har Gobind Korana și colegii au dezvoltat o metodă de fosfodiester în care 3'- O -acetilnucleozid-5'- O - fosfat a fost activat de N , N'- diciclohexilcarbodiimidă (DCC) sau clorură de p -toluensulfonil ( TsCl ) și apoi injectat în reacție cu o nucleozidă protejată cu 5'- O pentru a forma dinucleozid monofosfat [14] . După îndepărtarea grupării acetil protectoare în mediul bazic, s-a realizat o alungire suplimentară a lanțului. Seturi de oligonucleotide tri- și tetramerice au fost sintetizate prin condensare în trepte. În plus, s-a efectuat condensarea fragmentelor oligomerice pentru a obține oligonucleotide mai lungi [1] .

Protecția grupărilor fosfat în sinteza fosfodiesterului nu a fost utilizată, iar acest lucru, aparent, a condus la reacții secundare și a redus randamentul sintezei. Cu toate acestea, Korana credea că plasarea protecției pe grupările fosfat ar duce la pierderea principalului avantaj al oligonucleotidelor - natura polielectrolitică a acestora , care, credea el, ar putea fi folosită eficient pentru a purifica oligonucleotidele. O descoperire importantă a Coranului a fost utilizarea grupărilor de protecție tritil pentru a proteja nucleozidele 5’-hidroxil [1] .

Metoda fosfotrieterului

În anii 1960, grupuri conduse de R. Letsinger ( ing.  R. Letsinger ) [15] [16] și K. Reese ( ing.  C. Reese ) [17] au dezvoltat metoda fosfotriesterului. Diferența definitorie față de abordarea fosfodiesterului este protecția preliminară a fosfatului din reactant și produs cu gruparea cianoetil -CH 2 CH 2 CN. Această modificare a eliminat posibilitatea ramificării oligonucleotidelor la grupările fosfat. Selectivitatea mai mare a metodei a făcut posibilă utilizarea mai multor reactivi de condensare și catalizatori reactivi [18] [19] , ceea ce a redus semnificativ durata sintezei. Metoda fosfotriesterului a fost implementată atât în ​​soluție, cât și în fază solidă [1] .

Folosind această metodă, a fost posibilă sinteza a două oligonucleotide dublu catenare cu lungimea de 77 și 104 perechi de baze, a căror secvență corespundea lanțurilor A și B ale insulinei , ceea ce a făcut ulterior posibilă exprimarea cu succes a acestor gene [1] .

Metoda triesterului fosfit

În anii 1970 a fost introdusă în practică metoda fosfit triester pentru formarea legăturilor internucleozide, în care s-au folosit derivați nucleozidici mult mai reactivi pe bază de P(III), inițial clorofosfiți [20] . Ulterior, un grup condus de M. Caruthers a folosit fosfiți de 1H -tetrazolidă mai puțin agresivi și mai selectivi și a implementat metoda într-o versiune în fază solidă [21] . La scurt timp după aceea, angajații din același grup au îmbunătățit metoda utilizând amidofosfiții nucleozidici mai stabili ca elemente de bază . Înlocuirea grupării de protecție a metilfosfatului mai puțin practică [22] [23] [24] cu gruparea 2-cianoetil mai convenabilă [25] a dat varianta amidofosfiților nucleozidici, care este încă reactivul standard pentru sinteza oligonucleotidelor în prezent. Numeroase îmbunătățiri suplimentare ale metodelor de sinteză a blocurilor monomerice, sintetizatoarelor de oligonucleotide și protocoalelor de asamblare și deblocare au transformat abordarea amidofosfitului într-o metodă foarte fiabilă și productivă pentru obținerea oligonucleotidelor sintetice [26] .  

Sinteza prin metoda amidofosfitului

Blocuri de construcție

Nucleozide amidofosfiți

În 1976, Letsinger și colaboratorii au descoperit că compușii trivalenți ai fosforului sunt reactivi mult mai activi decât derivații de fosfor pentavalenti corespunzători. Rolul compușilor P(III) a devenit evident după dezvoltarea derivaților fosfit de N,N -diizopropilamidă ai nucleozidelor ( nucleozide amidofosfiți ) [1] [22] de către M. Carruthers , care joacă încă rolul de blocuri standard în amidă. metoda de sinteză a fosfitului astăzi. Pentru a preveni reacțiile secundare nedorite, grupările funcționale ale amidofosfiților trebuie blocate cu grupări protectoare . După ce asamblarea lanțului de oligonucleotide este finalizată, toate grupările protectoare sunt îndepărtate, rezultând oligonucleotida țintă. Mai jos sunt grupele protectoare utilizate în amidofosfiții nucleozidici standard disponibile comercial [27] :

  • Gruparea hidroxil din poziţia 5' este protejată de o grupare protectoare 4,4'-dimetoxitritil (DMT), care este îndepărtată în condiţii acide.
  • Timina și uracilul , bazele azotate ale timidinei și , respectiv, uridinei , nu au grupări amino exociclice, deci nu au nevoie de grupări protectoare. Guanina are o grupare amino exociclică cu bazicitate scăzută , deci nu reacționează secundar cu amidofosfiții în condiții de reacție de condensare. Cu toate acestea, reactivul amidofosfit pe bază de 5'- O -DMT-2'-deoxiguanozină neprotejat N2 este slab solubil în acetonitril  , solventul cel mai frecvent utilizat în sinteza oligonucleotidelor. Dimpotrivă, derivații protejați cu N2 ai aceluiași compus sunt foarte solubili în acetonitril și, prin urmare, sunt utilizați mult mai pe scară largă. Bazele azotate adenina și citozina conțin grupări amino care pot reacționa cu amidofosfiții în timpul sintezei și, prin urmare, aceste grupări trebuie protejate pentru sinteza în condiții standard. Cu toate acestea, prin introducerea unor etape suplimentare în ciclul sintetic, este posibil să se realizeze utilizarea amidofosfiților dA și dC neprotejați [28] . Grupările protectoare pe baze azotate trebuie păstrate pe toată durata sintezei, astfel încât se folosesc grupări a căror reactivitate este opusă celei a grupării 4,4’-dimetoxitritil, care este îndepărtată după fiecare ciclu. Cele două abordări cele mai frecvent utilizate sunt descrise mai jos.
    • În prima abordare standard, protecția cu benzoil (Bz) este utilizată pentru a proteja adenina și citozina , în timp ce guanina este protejată de o grupare izobutiril ( i Bu) [29] . Mai târziu , a fost propusă o grupare acetil (Ac) pentru a proteja citozina , care poate fi îndepărtată cu amoniac sau cu un amestec de amoniac și metilamină [30] .
    • În a doua schemă de protecție, mai blândă, adenina este protejată de grupări izobutiril [31] sau fenoxiacetil (PAC) [32] . Citozina conține o grupare de protecție a acetilului [30] , în timp ce guanina este protejată de grupări 4-izopropilfenoxiacetil ( i Pr-PAC) [33] sau dimetilformamidină (dmf) [34] . Grupările protectoare moi sunt îndepărtate mai ușor decât cele standard, cu toate acestea, amidofosfiții cu aceste grupări sunt mai puțin stabile atunci când sunt depozitate în soluție.
  • Gruparea fosfit este protejată de o grupare 2-cianoetil [25] . Prezența protecției cu fosfit este obligatorie pentru amidofosfit și grupul triester fosfit nou format înainte ca acesta din urmă să fie oxidat la fosfotriester. În același timp, prezența protecției pe grupările fosfat ale unui fragment de oligonucleotide deja asamblat nu este necesară pentru ciclurile de condensare ulterioare de succes [35] .
  • Sinteza ARN utilizează blocuri de construcție cu o grupare 2’-hidroxil „extra” care nu este implicată în sinteză. Este protejat cu o grupare tert -butildimetilsilil (TBDMS) [36] [37] [38] sau triizopropilsililoximetil (TOM) [39] [40] . Ambele grupări sunt îndepărtate prin acțiunea ionului de fluor .
  • Gruparea fosfit conține de asemenea o grupare diizopropilamină ( i - Pr2N ) reactivă în condiții acide. La activarea sub acțiunea unui catalizator acid, această grupare este înlocuită cu gruparea 5’-hidroxil a lanțului în creștere [22] .
Amidofosfiți non-nucleozidici

Amidofosfiții non-nucleozidici sunt reactivi amidofosfit proiectați pentru a introduce o varietate de grupări funcționale și etichete la poziția terminală a unei oligonucleotide sau între resturile de nucleotide din mijlocul unei secvențe. Pentru a fi adecvat pentru introducerea la mijlocul lanțului, amidofosfitul trebuie să conțină cel puțin două grupări hidroxil, dintre care una este protejată de o grupare DMT, iar cealaltă poartă un fragment reactiv de amidofosfit.

Amidofosfiții non-nucleozidici sunt utilizați pentru a introduce în oligonucleotide diferite grupări care nu se găsesc în nucleozidele naturale. A fost sintetizată o gamă largă de reactivi similari, care servesc, de exemplu, pentru introducerea grupărilor 5’-fosfat [41] , grupării amino [42] , grupării mercapto [ 43] , aldehidei [44] și carboxil [45] , fragmente alchinice [46] , coloranți fluorescenți [ 47] și extinctori, modificări hidrofile [48] și hidrofobe [49] , biotină [50] , etc.

Ciclu sintetic

Sinteza oligonucleotidelor este realizată prin condensarea treptată a blocurilor de construcţie la capătul 5' al lanţului de creştere până când secvenţa ţintă este asamblată. Apariția reacțiilor secundare impune o limitare a lungimii oligonucleotidei sintetizate (până la 200 de resturi de nucleotide ), deoarece numărul de erori se acumulează odată cu creșterea lungimii produsului țintă [26] . Setul de operații necesare extinderii lanțului cu un rest de nucleotide se numește ciclu de sinteză și constă din patru reacții chimice.

Etapa 1: Îndepărtarea protecției tritil

Gruparea protectoare DMT este îndepărtată cu o soluție acidă, cum ar fi acid tricloracetic 2% sau acid dicloracetic 3% într-un solvent inert ( clorură de metilen sau toluen ). Cationul dimetoxitritil portocaliu rezultat este spălat din sistem. Ca rezultat, se formează un precursor de oligonucleotidă cu o grupare 5'-hidroxil liberă fixată pe un purtător în fază solidă. Efectuarea procesului pentru o perioadă mai lungă de timp sau folosirea unor soluţii acide mai concentrate duce la o reacţie secundară de depurare  - eliminarea bazelor purinice din reziduul de riboză .

Etapa 2: Condens

O soluție de nucleozidă amidofosfit (0,02–0,2 M) sau un amestec de mai multe amidofosfiți în acetonitril este activată cu o soluție 0,2–0,7 M de catalizator acid pe bază de azol : 1 H - tetrazol , 2-etiltiotetrazol [51] , 2 -benziltiotetrazol [52] , 4,5-dicianimidazol [53] , etc. Amestecarea componentelor are loc în liniile de comunicație ale sintetizatorului în timpul livrării reactivilor în reactor care conține un purtător în fază solidă. Amidofosfitul activat într-un exces de 1,5-20 ori este introdus în interacțiune cu gruparea 5’-hidroxil, formând o legătură triester fosfit. Condensarea amidofosfiților 2’-deoxinucleozidelor are loc foarte rapid și durează, de regulă, aproximativ 20 de secunde la scară mică. Amidofosfiții îngreunați steric ale ribonucleozidelor reacţionează mult mai lent (5-15 min) [54] [55] [56] [57] . Reacția este destul de sensibilă la prezența apei, în special atunci când se utilizează soluții diluate de amidofosfiți, deci se efectuează într-un solvent anhidru, de obicei acetonitril . Odată cu creșterea scalei de sinteză, se folosesc excese mai mici și soluții mai concentrate de amidofosfiți. După terminarea reacţiei, reactanţii în exces şi produşii secundari sunt îndepărtaţi din reactor prin spălare.

Etapa 3: Limitare

Capsularea se realizează prin tratarea unui purtător în fază solidă cu un amestec de anhidridă acetică și 1-metilimidazol (mai rar DMAP ) ca catalizator . În cadrul sintezei amidofosfitului, această etapă are două scopuri:

  • După terminarea etapei de condensare, o mică fracțiune din grupările 5’-hidroxil (0,1-1%) rămâne nereacționată și trebuie îndepărtată din procesul de alungire ulterioară a lanțului pentru a preveni formarea oligonucleotidelor cu resturi de nucleotide lipsă în interior. lantul. În acest scop, grupările hidroxil rămase sunt protejate cu grupări acetil care sunt rezistente la soluțiile acide utilizate pentru îndepărtarea protecției DMT.
  • De asemenea, s-a raportat că amidofosfiții activați cu 1H -tetrazol reacţionează cu randament scăzut cu oxigenul carbonil în poziţia O 6 a guanozinei [58] . Când este oxidat cu un amestec de iod și apă, acest produs secundar suferă scindarea bazei purinice . Siturile de apurină rezultate sunt ușor hidrolizate în timpul deprotejării finale a oligonucleotidei, ceea ce duce la formarea a două oligonucleotide mai scurte și la o scădere a randamentului produsului țintă. Modificările O6 sunt îndepărtate rapid prin acţiunea unui agent de acoperire dacă acoperirea este efectuată înainte de etapa de oxidare.
Etapa 4: Oxidare

Gruparea fosfit tri-coordonată internucleozidă obținută ca urmare a condensării nu este naturală și are stabilitate limitată în condiții de sinteză. Tratarea suportului cu iod și apă în prezența unei baze slabe ( piridină , 2,6-lutidină sau colidină ) oxidează fosfitul la un fosfotriester, un precursor al legăturii internucleozide fosfodiester naturale. Oxidarea poate fi efectuată, de asemenea, în condiții anhidre folosind hidroperoxid de terț-butil [59] sau un reactiv mai convenabil, (1 S )-(+)-(10-camforsulfonil)oxaziridină [60] .

Purtători în stare solidă

Pe parcursul sintezei în fază solidă, oligonucleotida este legată covalent de purtătorul în fază solidă prin gruparea 3'-hidroxil. Suportul este de obicei plasat în coloane, a căror dimensiune depinde de scara sintezei. În ultimii 10 ani s-au răspândit sintetizatoarele de oligonucleotide de înaltă performanță, în care purtătorul este plasat în godeurile plăcii (96 sau 384 godeuri pe placă) [61] . După terminarea sintezei, oligonucleotida este scindată din purtător și intră în soluție.

Material media
Dimensiunea porilor CPG, Å [62] Încărcare,
µmol/g		 Lungimea produsului,
baze
500 80-90 <50
1000 50-60 80
1500 35-45 100
2000 20-30 150
3000 200

Spre deosebire de sinteza organică în fază solidă și sinteza de peptide, sinteza oligonucleotidelor se desfășoară mai bine pe purtătorii în fază solidă care nu se umfla sau se umflă slab. Cei mai des utilizați purtători sunt sticla cu pori controlați (CPG) și polistirenul macroporos (MPPS) [ 63] . 

  • Principala caracteristică a CPG este diametrul porilor , care poate fi de la 70 la 4000 Å , în timp ce porii sunt foarte uniformi ca mărime (abaterea este de ±10% pentru 80% din pori). Pentru a face un astfel de suport adecvat pentru sinteza, acesta este tratat cu (3-aminopropil)trietoxisilan (APTES) pentru a da aminopropil CPG. Aminoalchil CPG cu lanț lung , LCAA CPG sunt  , de asemenea, adesea folosite [63] . Două caracteristici cheie ale sintezei depind de dimensiunea porilor: scara, determinată de numărul de grupări funcționale active pe unitatea de masă a purtătorului și lungimea maximă a oligonucleotidului sintetizat. Datele despre cei mai comuni purtători CPG sunt date în tabelul [62] .
  • De asemenea, în sinteza oligonucleotidelor se folosește polistirenul macroporos, obținut prin copolimerizarea stirenului și divinilbenzenului , cu modificarea aminometil introdusă. Acest polistiren face posibilă sinteza oligonucleotidelor cu o lungime mai mică de 40-50 de baze. Pentru sinteze mici, un purtător de polistiren poate fi utilizat cu o încărcare de 10 până la 45 µmol/g. Pentru sintezele pe o scară de 25-100 µmol, polistirenul este utilizat cu o încărcare de 200 până la 400 µmol/g. În cele din urmă, polistirenul este mai potrivit decât CPG pentru sinteze la scară mare (mai mare de 100 µmol) [62] .
Chimia linkerului

În scopul sintezei oligonucleotidelor, succinaţii nucleozidici sau linkerii non-nucleozidici sunt ataşaţi covalent la grupările amino ale CPG aminopropil, CPG LCAA sau MPPS aminometil. În mod obișnuit, sunt utilizate trei tipuri diferite de medii.

  • Purtători de nucleozide . În prima abordare istorică, sinteza unei oligonucleotide este efectuată pe un purtător, la care o nucleozidă inițială 3’-terminală este atașată covalent în prealabil printr-un fragment de acid succinic . În consecință, sinteza începe cu adăugarea unui amidofosfit corespunzător nu primei, ci celei de-a doua nucleotide, numărând de la capătul 3’. Dezavantajul unui astfel de purtător este că, înainte de începerea sintezei, este necesar să se selecteze varianta purtătorului nucleozidic corespunzătoare nucleozidei 3’-terminale din oligonucleotida sintetizată, ceea ce reduce productivitatea procesului de sinteză și crește probabilitatea erorii umane. [64] . Purtători alternativi în fază solidă cu un distanțier pe bază de acizi diglicolic și oxalic au fost, de asemenea, propuși pentru separarea mai rapidă a produsului de purtător [63] .
  • Media universală . În această metodă, sinteza începe cu un purtător universal, la care este atașat un linker non-nucleozidic [65] . Amidofosfitul, corespunzător nucleozidei 3’-terminale, este atașat de purtătorul universal conform metodelor standard în timpul primului ciclu de sinteză. După aceea, asamblarea secvenței dorite este continuată și apoi oligonucleotida este scindată de la suprafața purtătorului. Avantajul acestei abordări este că în toate sintezele, indiferent de secvența care trebuie sintetizată, poate fi utilizat un singur purtător universal [64] .
  • Suporturile speciale sunt utilizate pentru a atașa un grup funcțional sau raportor la poziția 3’ a oligonucleotidelor sintetice. Purtătorii sunt disponibili comercial pentru introducerea grupărilor amino [66] , grupărilor mercapto [ 67] , extinctorilor de fluorescență [68] , etc.

Oligonucleotide tiofosfat și sinteza lor

Oligonucleotidele tiofosfat sunt oligonucleotide modificate în care unul dintre atomii de oxigen din restul de fosfat este înlocuit cu un atom de sulf . Numai acei tiofosfați sunt utilizați pe scară largă în care sulful nu este o legătură între restul nucleozidic și atomul de fosfor. În acest caz, înlocuirea oxigenului cu sulf duce la formarea unui nou centru de chiralitate pe atomul P(V), prin urmare, în cel mai simplu caz al unei dinucleotide, se formează diastereomeri S P și R P. Într -o oligonucleotidă n -mer în care toate legăturile internucleotide ( n - 1) sunt tiofosfat, numărul de diastereomeri este 2 ( n - 1) . Ca analogi nenaturali ai acizilor nucleici, tiofosfații de oligonucleotide sunt semnificativ mai rezistenți la hidroliză de către nucleaze , o clasă de enzime care scindează acizii nucleici prin hidroliza legăturii PO a punții fosfodiester. Această proprietate determină utilizarea tiofosfaților ca oligonucleotide antisens în aplicații in vivo și in vitro în care expunerea la nucleaze este inevitabilă. În mod similar, pentru a crește stabilitatea ARN-urilor interferente mici , cel puțin o legătură tiofosfat este adesea introdusă în poziția 3’ a catenelor sens și antisens. În tiofosfații oligonucleotid optic puri, diastereomerii în care toți centrii de fosfor au configurația S P sunt mai rezistenți la hidroliză enzimatică decât omologii lor R P. Totuși, sinteza tiofosfaților optic puri este dificilă [69] [70] .

Sinteza tiofosfaților de oligonucleotide este similară cu sinteza oligonucleotidelor naturale. Diferența este că etapa de oxidare este înlocuită cu o reacție de sulfurare. Următorii reactivi disponibili comercial sunt utilizați pentru introducerea sulfului:

  • 3-(Dimetilaminometilideneamino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona ( DDTT ) asigură o viteză mare de sulfurare și este stabilă în soluție [71] .
  • Reactivul Beaucage  are o solubilitate mai mare în acetonitril și permite reacției să continue într-un timp mai scurt . Cu toate acestea, are stabilitate limitată în soluție și este mai puțin eficient la sulfurarea legăturilor ARN [72] .
  • Disulfura de N,N,N',N'-Tetraetilthiuram ( TETD ) este solubilă în acetonitril, totuși, reacția de sulfurare a legăturii internucleozide ADN durează 15 minute, ceea ce este de 10 ori mai lentă decât în ​​cazul celor doi compuși anteriori . 73] .

Au fost dezvoltați și alți reactivi de sulfurare [74] .

În sinteza oligonucleotidelor de tiofosfat, etapa de acoperire este efectuată după sulfurare. Dacă acoperirea se efectuează înainte de sulfurare, atunci după acoperire purtătorul în fază solidă poate conține cantități reziduale de anhidridă acetică și 1-metilimidazol. Amestecul de acoperire împiedică reacția de transfer al sulfului, ceea ce duce la formarea de oligonucleotide de tiofosfat cu un conținut crescut de unități de fosfat. În acest caz, se recomandă efectuarea acoperirii după reacția de sulfurare [71] .

Automatizare

Anterior, sinteza oligonucleotidelor a fost efectuată manual în soluție sau pe fază solidă. Pentru sinteza în fază solidă s-au adaptat diverse dispozitive pe bază de seringi cu membrane poroase sau filtre de sticlă miniaturale, care fac posibilă spălarea purtătorului în fază solidă cu soluții de reactivi și îndepărtarea acestora cu ajutorul vidului [76] .

În prezent, sinteza în fază solidă este realizată automat în sintetizatoare de oligonucleotide controlate de computer. Aceste dispozitive constau dintr-o serie de supape conectate la recipiente de reactivi, precum și solenoizi care deschid sau închid una sau alta supapă. La rândul lor, solenoizii sunt controlați de un computer care rulează programul de sinteză. Când supapa este deschisă, un anumit reactiv este pompat prin coloana care conține purtătorul în fază solidă pentru timpul specificat de program. Timpul și secvența de alimentare cu reactiv sunt constante pentru fiecare ciclu de sinteză; singura variabilă este reactantul monomer care trebuie condensat într-un ciclu dat. Selecția sa se face și de către program în conformitate cu secvența de oligonucleotide specificată [77] .

Sinteza poate fi implementată în format coloană, placă sau cip. Metoda de sinteză pe coloană este potrivită pentru cercetare sau sinteza pe scară largă a acestor polimeri, unde nu este necesar un randament ridicat al sintezei lor. Formatul plăcii este conceput special pentru sinteza la scară mică, de mare capacitate, pentru a satisface cererea în creștere din industrie și știință pentru oligonucleotide sintetice. Diverse tipuri de sintetizatoare sunt disponibile comercial [78] [79] [80] .

Prelucrare postsintetică

Pentru a obține oligonucleotida țintă, este necesar să se îndepărteze toate grupările protectoare ale oligonucleotidei:

  • o grupare 5' DMT;
  • grupări protectoare acil pe baze azotate;
  • Grupări 2-cianoetil care protejează grupările fosfat internucleozide.

Gruparea 5’-DMT este de obicei îndepărtată cu o soluție acidă în timpul sintezei automate. Scindarea oligonucleotidei de suport, deprotejarea bazelor și a grupărilor protectoare cianoetil au loc de obicei simultan sub acțiunea bazelor anorganice sau aminelor . De obicei, în aceste scopuri se utilizează amoniacul apos , o soluție de metilamină , amestecurile acestora [30] , amoniacul gazos sau metilamină [81] , mai rar soluții de alte amine primare și alcaline la temperatura camerei sau la temperatură ridicată. Acest tratament îndepărtează toate grupările protectoare din 2’-deoxioligonucleotidele, lăsând o soluție a produsului final. În cazul oligoribonucleotidelor protejate cu 2'- O -silil, se adaugă o etapă pentru îndepărtarea grupărilor protectoare silil sub acţiunea ionului de fluor [82] .

Aplicarea acestei metode este limitată de faptul că această prelucrare produce acrilonitril ca produs secundar . În condiții de deprotecție, acrilonitrilul poate alchila bazele azotate, în principal poziția N3 a timinei și uracilului , pentru a forma derivați 2-cianoetil prin reacția Michael . Formarea acestor produse secundare poate fi evitată prin tratarea oligonucleotidelor legate de purtătorul în fază solidă cu soluții de baze într-un solvent organic, cum ar fi 50% trietilamină în acetonitril [83] sau 10% dietilamină în acetonitril [84] .

O oligonucleotidă neprotejată poate fi utilizată fără purificare suplimentară sau purificată suplimentar prin una dintre următoarele metode [85] .

  • Cea mai brută metodă de purificare a unei oligonucleotide este desalinizarea, adică separarea impurităților cu greutate moleculară mică formate în timpul eliminării grupărilor protectoare ( benzamidă , izobutiramidă , acetat de amoniu etc.). Pentru cantități mari de oligonucleotide, desalinizarea se realizează în mod convenabil prin precipitare în etanol : în acest caz, produsul precipită, în timp ce impuritățile și, în unele cazuri, oligonucleotidele mai scurte rămân în soluție. Pentru cantități mici se folosește filtrarea cu gel [86] .
  • Purificarea oligonucleotidelor trunchiate poate fi realizată eficient utilizând electroforeză pe gel de poliacrilamidă , care se bazează pe separarea oligonucleotidelor după dimensiune datorită mobilității lor diferite în gel sub influența unui câmp electric. După electroforeza cu absorbție în ultraviolete , se determină un fragment de gel care conține oligonucleotida țintă, această parte este excizată, iar oligonucleotida purificată este izolată prin înmuiere sau electroeluare [87] .
  • Cea mai completă purificare este realizată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). În această metodă, separarea se bazează pe interacțiunea hidrofobă (HPLC cu fază inversă) sau de sarcină (HPLC cu schimb de ioni) a oligonucleotidelor cu un sorbant. Puterea acestei interacțiuni afectează ordinea și timpul de eluare a produsului din coloana cromatografică, ceea ce face posibilă separarea eficientă a produselor de diferite lungimi. O abordare alternativă este adesea utilizată în care gruparea 5'-DMT a oligonucleotidei nu este îndepărtată înainte de purificare. În acest caz, datorită prezenței unei grupări de protecție hidrofobe, hidrofobicitatea acesteia și puterea de interacțiune cu sorbentul hidrofob cresc semnificativ, iar mobilitatea cromatografică scade, ceea ce face izolarea produsului mai eficientă. Gruparea DMT este apoi îndepărtată într-un mediu acid, iar soluția este evaporată și desarate [88] .

Caracterizare

Ca și în cazul altor substanțe organice, este utilă caracterizarea oligonucleotidei după ce a fost preparată. În cazuri mai complexe (cercetare sau sinteză la scară largă), aceasta se face de două ori: după deprotejare și după purificare. Deși cea mai corectă abordare pentru a caracteriza o oligonucleotidă este secvențierea , o procedură relativ ieftină și de rutină, considerentele economice împiedică introducerea acesteia în producția de oligonucleotide. În practica zilnică, este suficient să se obțină greutatea moleculară a unei oligonucleotide prin înregistrarea spectrului de masă al acesteia . Sunt utilizate două metode de spectrometrie de masă: electrospray și spectrometrie de masă MALDI . Pentru a obține un spectru informativ, este important să înlocuiți toți ionii metalici care pot fi prezenți în probă cu ioni de amoniu sau trialchilamoniu.

  • Când este ionizată cu un electrospray, o oligonucleotidă produce un set de ioni care corespund unor grade diferite de ionizare a compusului. O oligonucleotidă cu o greutate moleculară M dă ioni cu mase ( M  - n H) / n , unde M  este greutatea moleculară a oligonucleotidei în formă acidă (toate sarcinile negative ale legăturilor fosfodiesterice sunt compensate de prezența protonilor), n  este gradul de ionizare, H este masa atomică a atomului de hidrogen (1 Da). Ionii cu n de la 2 la 5 sunt cei mai utili pentru caracterizare.Software -ul furnizat cu instrumentele moderne este capabil să caute automat vârfurile ionilor aparținând unei anumite oligonucleotide și să calculeze greutatea moleculară a acesteia din urmă.
  • Pentru a obține informații mai detaliate despre impuritățile dintr-o oligonucleotidă, se folosesc metode analitice care combină HPLC și spectrometria de masă [89] sau electroforeza capilară și spectrometria de masă [90] .

Vezi și

Note

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Reese CB Oligo- și poli-nucleotide: 50 de ani de sinteză chimică   // Org . Biomol. Chim. - 2005. - Vol. 3 , nr. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .
  2. ↑ Brown DM O scurtă istorie a sintezei oligonucleotidelor // Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. - Springer, 1993. - P. 1-17. — (Metode în biologie moleculară). - doi : 10.1385/0-89603-281-7:1 .
  3. ↑ Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Sinteza oligonucleotidelor // Chimie cuprinzătoare a produselor naturale. - Elsevier, 1999. - P. 105-152.
  4. ↑ Michelson AM, Todd AR Nucleotides partea XXXII. Sinteza unei dinucleotide ditimidinice care conține o legătură internucleotidă 3′: 5′  (engleză)  // J. Chem. soc. - 1955. - P. 2632-2638 . - doi : 10.1039/JR9550002632 .
  5. ↑ Hall RH, Todd A., Webb RF 644. Nucleotides. Partea XLI. Anhidride mixte ca intermediari în sinteza fosfaților dinucleozidici  //  J. Chem. soc. - 1957. - P. 3291-3296 . - doi : 10.1039/JR9570003291 .
  6. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD Sinteza ADN-ului prin deoxinucleozidă H-fosfonat intermediari   // Nucl . Acizi Res. - 1986. - Vol. 14 , nr. 13 . - P. 5399-5407 . doi : 10.1093 / nar/14.13.5399 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  7. ↑ Garegg PJ, Lindh I., Regberg T., Stawinski J., Strömberg R. Nucleoside H-phosphonates. III. Sinteza chimică a oligodeoxirribonucleotidelor prin abordarea hidrogenfosfonat  (engleză)  // Tetrahedron Lett. - 1986. - Vol. 27 , nr. 34 . - P. 4051-4054 ​​. - doi : 10.1016/S0040-4039(00)84908-4 .
  8. ↑ 1 2 Wada T., Sato Y., Honda F., Kawahara S., Sekine M. Chemical Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides Using N-Unprotected H-Phosphonate Monomers and Carbonium and Phosphonium Condensing Reagents: O-Selective Phosphonylation and Jden .Amer. Chim. soc. - 1997. - T. 119 , nr. 52 . - S. 12710-12721 . - doi : 10.1021/JA9726015 .
  9. ↑ Agrawal S., Tang JY Sinteza eficientă a oligoribonucleotidei și a analogului său de fosforotioat folosind abordarea H-fosfonat // Tetrahedron Lett. - 1990. - T. 31 , nr. 52 . - S. 7541-7544 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9 .
  10. ↑ Tram K., Wang X., Yan H. Facile Synthesis of Oligonucleotide Phosphoroselenoates // Org. Lett. - 2007. - T. 9 , Nr. 24 . - S. 5103-5106 . - doi : 10.1021/ol702305v .
  11. ↑ Froehler BC Deoxinucleozidă H-fosfonat diester intermediari în sinteza analogilor de fosfat internucleotid // Tetrahedron Lett. - 1986. - T. 27 , nr 46 . - S. 5575-5578 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7 .
  12. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD Analogi fosforamidați ai ADN-ului: sinteza și stabilitatea termică a heteroduplexurilor // Nucl. Acizi Res. - 1988. - T. 16 , nr 11 . - S. 4831-4839 . doi : 10.1093 / nar/16.11.4831 .
  13. ↑ Kung PP, Jones RA H-fosfonat ADN sinteza fără protecție amino // Tetrahedron Lett. - 1992. - T. 33 , nr 40 . - S. 5869-5872 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4 .
  14. ↑ Gilham PT, Khorana HG Studies on Polynucleotides. I. O metodă nouă și generală pentru sinteza chimică a legăturii internucleotidice C5″-C3″. Sinteze de deoxiribo-dinucleotide  (engleză)  // J. Am. Chim. soc. - 1958. - Vol. 80 , nr. 23 . - P. 6212-6222 . - doi : 10.1021/ja01556a016 .
  15. ^ Letsinger RL, Mahadevan V. Stepwise Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides on an Insoluble Polymer Support  //  J. Am. Chim. soc. - 1966. - Vol. 88 , nr. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.
  16. ↑ Letsinger RL, Ogilvie KK Nucleotide Chemistry. XIII. Sinteza oligotimidilaților prin intermediari fosfotriester  (engleză)  // J. Am. Chim. soc. - 1969. - Vol. 91 , nr. 12 . - P. 3350-3355 . - doi : 10.1021/ja01040a042 .
  17. ↑ Reese CB Sinteza chimică a oligo- și poli-nucleotidelor prin abordarea fosfotriesterului   // Tetrahedron . - 1978. - Vol. 34 , nr. 21 . - P. 3143-3179 . - doi : 10.1016/0040-4020(78)87013-6 .
  18. ↑ Efimov VA, Buryakova AA, Reverdatto SV, Chakhmakhcheva OG, Ovchinnikov Yu. A. Sinteza rapidă a dezoxiribooligonucleotidelor cu lanț lung prin metoda fosfotriesterului N-metilimidazolid   // Nucl . Acizi Res. - 1983. - Vol. 11 , nr. 23 . - P. 8369-8387 . doi : 10.1093 / nar/11.23.8369 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  19. ↑ Efimov VA, Molchanova NS, Chakhmakhcheva OG Abordarea sintezei oligonucleotidelor naturale și modificate prin metoda fosfotriesterului folosind cataliză intramoleculară O-nucleofilă  //  Nucleozide, nucleotide și acizi nucleici. - 2007. - Vol. 26 , nr. 8-9 . - P. 1087-1093 . - doi : 10.1080/15257770701516268 . — PMID 18058542 .
  20. ↑ Letsinger RL, Finnan JL, Heavner GA, Lunsford WB Nucleotide Chemistry. XX. Procedura de cuplare a fosfiților pentru generarea de legături internucleotide  //  J. Am. Chim. soc. - 1975. - Vol. 97 , nr. 11 . - P. 3278-3279 . - doi : 10.1021/ja00844a090 . — PMID 1133350 .
  21. ↑ Matteucci MD, Caruthers MH Sinteza dezoxioligonucleotidelor pe un suport polimeric  //  J. Am. Chim. soc. - 1981. - Vol. 103 , nr. 11 . - P. 3185-3191 . - doi : 10.1021/ja00401a041 .
  22. ↑ 1 2 3 Beaucage SL, Caruthers MH Deoxynucleoside phosphoramidites—O nouă clasă de intermediari cheie pentru sinteza deoxipolinucleotidelor  //  Tetrahedron Lett. - 1981. - Vol. 22 , nr. 20 . - P. 1859-1862 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 .
  23. ↑ McBride LJ, Caruthers MH Nucleotide chemistry. X. O investigație a mai multor fosforamidite deoxinucleozide utile pentru sintetizarea deoxioligonucleotidelor // Tetrahedron Lett. - 1983. - T. 24 , nr 3 . - S. 245-248 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3 .
  24. ↑ Adams SP, Kavka KS, Wykes EJ, Holder SB, Galluppi GR Reactivi fosfit dialchilamino nucleozidici împiedicați în sinteza a doi ADN 51-meri // J. Amer. Chim. soc. - 1983. - T. 105 , nr 3 . - S. 661-663 . - doi : 10.1021/ja00341a078 .
  25. ↑ 1 2 Sinha ND, Biernat J., McManus J., Köster H. Sinteza oligonucleotidelor suport polimeric XVIII1.2): utilizarea β-cianoethyi-N,N-dialchilamino-/N-morfolino fosforamidit al deoxinucleozidelor pentru sinteza ADN-ului fragmente care simplifică deprotejarea și izolarea produsului final   // Nucl . Acizi Res. - 1984. - Vol. 12 , nr. 11 . - P. 4539-4557 . doi : 10.1093 / nar/12.11.4539 .
  26. ↑ 1 2 Beaucage SL, Iyer RP Advances in the Synthesis of Oligonucleotids by Phosphoramidite Approach   // Tetrahedron . - 1992. - Vol. 48 , nr. 12 . - P. 2223-2311 . - doi : 10.1016/S0040-4020(01)88752-4 .
  27. ↑ Glen Research. Reactivi sintetizatori ADN și ARN Applied Biosystems  . Preluat la 2 decembrie 2012. Arhivat din original la 16 ianuarie 2013.
  28. ↑ Gryaznov SM, Letsinger RL Sinteza oligonucleotidelor prin monomeri cu baze neprotejate  //  J. Am. Chim. soc. - 1991. - Vol. 113 , nr. 15 . - P. 5876-5877 . doi : 10.1021 / ja00015a059 .
  29. ↑ Virta P. Sinteza în fază solidă a oligonucleotidelor sensibile la bază   // ARKIVOC . - 2009. - P. 54-83 . - ISSN 1551-7012 . Arhivat din original pe 11 octombrie 2015.
  30. ↑ 1 2 3 Reddy MP, Hanna NB, Farooqui F. Clivarea ultrarapidă și deprotecția oligonucleotidelor Sinteza și utilizarea derivaților  C Ac //  Nucleozide și nucleotide. - 1997. - Vol. 16 , nr. 7-9 . - P. 1589-1598 . - doi : 10.1080/07328319708006236 .
  31. ↑ McMinn DL, Greenberg MM Sinteza oligonucleotidelor care conțin 3’-alchil amine utilizând deoxiadenozin fosforamidit protejat cu N-izobutiril  //  Tetrahedron Lett. - 1997. - Vol. 38 , nr. 18 . - P. 3123-3126 . - doi : 10.1016/S0040-4039(97)00568-6 .
  32. ↑ Schulhof JC, Molko D., Teoule R. Etapa finală de deprotejare în sinteza oligonucleotidelor este redusă la un tratament ușor și rapid cu amoniac prin utilizarea grupărilor de protecție a bazelor labile   // Nucl . Acizi Res. - 1987. - Vol. 15 , nr. 2 . - P. 397-416 . doi : 10.1093 / nar/15.2.397 . — PMID 3822812 . Arhivat din original pe 14 martie 2022.
  33. ↑ Zhu Q., Delaney MO, Greenberg MM Observarea și eliminarea N-acetilării oligonucleotidelor preparate folosind fosforamidite cu deprotecție rapidă și deprotecție ultra-ușoară   // Bioorg . Med. Chim. Lett. - 2001. - Vol. 11 , nr. 9 . - P. 1105-1107 . - doi : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5 . — PMID 11354354 .
  34. ↑ McBride LJ, Kierzek R., Beaucage SL, Caruthers MH Nucleotide chemistry. 16. Grupări protectoare amidinei pentru sinteza oligonucleotidelor  (engleză)  // J. Am. Chim. soc. - 1986. - Vol. 108 , nr. 8 . - P. 2040-2048 . doi : 10.1021 / ja00268a052 .
  35. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Cuplarea fosforamiditului la oligonucleotide care poartă fragmente de fosfat internucleosidic neprotejate  //  J. Org. Chim. - 2001. - Vol. 66 , nr. 5 . - P. 1798-1804 . - doi : 10.1021/jo001591e . — PMID 11262130 .
  36. ↑ Ogilvie KK, Theriault N., Sadana KL Sinteza oligoribonucleotidelor  //  J. Am. Chim. soc. - 1977. - Vol. 99 , nr. 23 . - P. 7741-7743 . - doi : 10.1021/ja00465a073 .
  37. ↑ Usman N., Pon RT, Ogilvie KK Prepararea ribonucleozidelor 3′-O-fosforamidite și aplicarea lor la sinteza automată în fază solidă a oligonucleotidelor  //  Tetrahedron Lett. - 1985. - Vol. 26 , nr. 38 . - P. 4567-4570 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7 .
  38. ↑ Scaringe SA, Francklyn C., Usman N. Sinteza chimică a oligoribonucleotidelor biologic active folosind fosforamidite ribonucleozidice protejate cu β-cianoetil   // Nucl . Acizi Res. - 1990. - Vol. 18 , nr. 18 . - P. 5433-5441 . doi : 10.1093 / nar/18.18.5433 .
  39. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Wu X., Ackermann D., Honegger T. Sinteză automată rapidă și fiabilă a ARN și a precursorilor protejați parțial 2′-O- („ARN-ul în cușcă”) pe baza a două noi, 2′- ortogonale O-Protecting Groups, Comunicare preliminară   // Helv . Chim. acta. - 1999. - Vol. 82 , nr. 10 . - P. 1753-1761 . - doi : 10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10<1753::AID-HLCA1753>3.0.CO;2-Y .
  40. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Jenny L., Stutz A., Wu X. Sinteza chimică fiabilă a oligoribonucleotidelor (ARN) cu 2′-O-[(Triisopropilsilil)oxi]metil(2′-O-tom)-protejat Fosforamidiți  (engleză)  // Helv. Chim. acta. - 2001. - Vol. 84 , nr. 12 . - P. 3773-3795 . - doi : 10.1002/1522-2675(20011219)84:12<3773::AID-HLCA3773>3.0.CO;2-E .
  41. ↑ Guzaev A., Salo H., Azhayev A., Lönnberg H. O nouă abordare pentru fosforilarea chimică a oligonucleotidelor la capătul 5′-terminal   // Tetrahedron . - 1995. - Vol. 51 , nr. 34 . - P. 9375-9384 . - doi : 10.1016/0040-4020(95)00544-I .
  42. ↑ Sinha ND, Cook RM Prepararea și aplicarea oligonucleotidelor sintetice funcționalizate: III. Utilizarea derivaților H-fosfonați ai amino-hexanolului protejat și mercapto-propanolului sau -hexanolului  //  Nucl. Acizi Res. - 1988. - Vol. 16 , nr. 6 . - P. 2659-2670 . doi : 10.1093 / nar/16.6.2659 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  43. ↑ Ede NJ, Tregear GW, Haralambidis J. Prepararea de rutină a oligonucleotidelor tiol: aplicare la sinteza hibrizilor oligonucleotide-peptide  //  Bioconjugate Chem. - 1994. - Vol. 5 , nr. 4 . - P. 373-378 . doi : 10.1021 / bc00028a016 . — PMID 7948105 .
  44. ↑ Podyminogin MA, Lukhtanov EA, Reed MW Atașarea sondelor oligodeoxinucleotidice modificate cu benzaldehidă la sticlă acoperită cu semicarbazide   // Nucl . Acizi Res. - 2001. - Vol. 29 , nr. 24 . - P. 5090-5098 . doi : 10.1093 / nar/29.24.5090 .
  45. ^ Lebedev AV, Combs D., Hogrefe RI Preactivated Carboxyl Linker for the Rapid Conjugation of Alkylamines to Oligonucleotides on Solid Support  //  Bioconjugate Chem. - 2007. - Vol. 18 , nr. 5 . - P. 1530-1536 . doi : 10.1021 / bc0603891 . — PMID 17877414 .
  46. ^ Alvira M., Eritja R. Synthesis of Oligonucleotides Carrying 5'-5' Linkages Using Copper-Catalyzed Cycloaddition Reactions   // Chem . biodiversitate. - 2007. - Vol. 4 , nr. 12 . - P. 2798-2809 . - doi : 10.1002/cbdv.200790229 . — PMID 18081090 .
  47. ↑ Kvach MV, Tsybulsky DA, Ustinov AV, Stepanova IA, Bondarev SL, Gontarev SV, Korshun VA, Shmanai VV 5(6 ) -Carboxyfluorescein Revisited: New Protecting Group, Separation of Isomers, and their Spectral Properties on Oligonucleoconjugates   / Oligonucleojugates . - 2007. - Vol. 18 , nr. 5 . - P. 1691-1696 . - doi : 10.1021/bc7001874 . — PMID 17696491 .
  48. ↑ Jäschke A., Fürste JP, Nordhoff E., Hillenkamp F., Cech D., Erdmann VA Sinteza și proprietățile conjugatelor oligodeoxirribonucleotid-polietilen glicol   // Nucl . Acizi Res. - 1994. - Vol. 22 , nr. 22 . - P. 4810-4817 . doi : 10.1093 / nar/22.22.4810 . — PMID 7984434 .
  49. ↑ Musumeci D., Montesarchio D. Sinteza unui derivat de fosforamidit de colesteril-HEG și aplicarea sa la conjugații de lipide ale secvenței  // moleculelor lui Hotoda 5'TGGGAG3' anti-HIV  . - 2012. - Vol. 17 . - P. 12378-12392 . - doi : 10.3390/molecules171012378 . — PMID 23090019 . Arhivat din original pe 2 noiembrie 2015.
  50. ↑ Kayushin A., Demekhina A., Korosteleva M., Miroshnikov A., Azhayev A. Sinteza linkerului fosforamidit care conține biotină cu braț distanțier polieter  //  Nucleozide, nucleotide și acizi nucleici. - 2011. - Vol. 30 , nr. 7-8 . - P. 490-502 . doi : 10.1080 / 15257770.2011.587702 . — PMID 21888541 .
  51. ↑ Sproat B., Colonna F., Mullah B., Tsou D., Andrus A., Hampel A., Vinayak R. An Efficient Method for the Isolation and Purification of Oligoribonucleotides  //  Nucleosides and Nucleotides. - 1995. - Vol. 14 , nr. 1-2 . - P. 255-273 . - doi : 10.1080/15257779508014668 .
  52. ↑ Welz R., Müller S. 5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazol ca activator pentru blocurile de construcție fosforamidite 2'-O-TBDMS în sinteza ARN  //  Tetrahedron Lett. - 2002. - Vol. 43 , nr. 5 . - P. 795-797 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2 .
  53. ↑ Vargeese C., Carter J., Yegge J., Krivjansky S., Settle A., Kropp E., Peterson K., Pieken W. Efficient activation of nucleoside phosphoramidites with 4,5-dicyanoimidazol during oligonucleotid synthesis   // Nucl. Acizi Res. - 1998. - Vol. 26 , nr. 4 . - P. 1046-1050 . - doi : 10.1093/nar/26.4.1046 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  54. ↑ Usman N., Ogilvie KK, Jiang MY, Cedergren RJ Sinteza chimică automată a oligoribuncleotidelor lungi folosind ribonucleozide 2’-O-sililate 3’-O-fosforamidite pe un suport de sticlă cu pori controlați: sinteza unei secvențe similare de 43 de nucleotide la jumătatea moleculei 3' a unui ARNt de formilmetionină de Escherichia coli // J. Amer. Chim. soc. - 1987. - T. 109 , nr. 25 . - S. 7845-7854 . doi : 10.1021 / ja00259a037 .
  55. ↑ Ogilvie KK, Usman N., Nicoghosian K., Cedergren RJ Sinteza chimică totală a unei secvențe de ARN de 77 de nucleotide având activitate de acceptare a metioninei  // Proc. Natl. Acad. sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. - 1988. - T. 85 , nr. 16 . - S. 5764-5768 . - doi : 10.1073/pnas.85.16.5764 . — PMID 3413059 .
  56. ↑ Wu T., Ogilvie KK, Perreault JP, Cedergren RJ Procedura convenabilă pentru prepararea polimerilor specifici ADN-ARN mixt // J. Amer. Chim. soc. - 1989. - T. 111 , nr. 22 . - S. 8531-8533 . - doi : 10.1021/ja00204a043 .
  57. ↑ Pon RT Eficiență de cuplare îmbunătățită utilizând 4-dimetilaminopiridină (DMAP) și fie tetrazol, 5-(o-nitrofenil)tetrazol, fie 5-(p-nitrofenil)tetrazol în sinteza în fază solidă a oligoribonucleotidelor prin procedura fosforamiditului // Tetrahedron Lett . - 1987. - T. 28 , Nr. 32 . - S. 3643-3646 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5 .
  58. ↑ Pon RT, Usman N., Damha MJ, Ogilvie KK Prevenirea modificării guaninei și a clivajului lanțului în timpul sintezei în fază solidă a oligonucleotidelor folosind derivați de fosforamidit   // Nucl . Acizi Res. - 1986. - Vol. 14 , nr. 16 . - P. 6453-6470 . doi : 10.1093 / nar/14.16.6453 . — PMID 3748816 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  59. ↑ Alul RH, Singman CN, Zhang G., Letsinger RL Oxalil -CPG: un suport labil pentru sinteza derivaților oligonucleotidici sensibili  // Nucl. Acizi Res. - 1991. - T. 19 , nr 7 . - S. 1527-1532 . - doi : 10.1093/nar/19.7.1527 . — PMID 2027761 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  60. ↑ Produs nou : 0,5M CSO pentru oxidarea non-apoasă în sinteza ADN  . glenres.com. Data accesului: 28 ianuarie 2013. Arhivat din original pe 4 februarie 2013.
  61. ↑ BioAutomation. Sintetizator de oligonucleotide ADN/ARN: MerMade 384 (link indisponibil) . Consultat la 3 decembrie 2012. Arhivat din original la 30 septembrie 2011. 
  62. ↑ 1 2 3 Guzaev AP, Pon RT Attachment of Nucleosides and Other Linkers to Solid-Phase Supports for Oligonucleotid Synthesis // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry . Wiley, 2013.
  63. ↑ 1 2 3 Pon RT Suporturi în fază solidă pentru sinteza oligonucleotidelor // Protocoale curente în chimia acidului nucleic. - Wiley, 2001.
  64. ↑ 1 2 Vaijayanthi B., Kumar P., Ghosh PK, Gupta KC Progrese recente în sinteza oligonucleotidelor și aplicațiile lor  //  Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - Vol. 40 , nr. 6 . - P. 377-391 . — PMID 22900365 . Arhivat din original pe 14 august 2017.
  65. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. A Conformationally Preorganized Universal Solid Support for Efficient Oligonucleotide Synthesis  //  J. Am. Chim. soc. - 2003. - Vol. 125 , nr. 9 . - P. 2380-2381 . - doi : 10.1021/ja0284613 . — PMID 12603111 .
  66. ↑ Petrie CR, Reed MW, Adams AD, Meyer Jr. RB Un suport CPG îmbunătățit pentru sinteza oligonucleotidelor cu coadă 3’-amină  //  Bioconjugate Chem. - 1992. - Vol. 3 , nr. 1 . - P. 85-87 . - doi : 10.1021/bc00013a014 . — PMID 1616954 .
  67. ↑ Link Technologies. Modificator de 3'-tiol C3 SS CPG (link indisponibil) . Data accesului: 4 decembrie 2012. Arhivat din original la 29 iunie 2013. 
  68. ↑ Lumiprobe. Black Hole 1 (BHQ-1) stingător CPG (link indisponibil) . Data accesului: 4 decembrie 2012. Arhivat din original pe 23 noiembrie 2010. 
  69. ^ Wilk A., Grajkowski A., Phillips LR, Beaucage SL N-acilfosforamidite ciclice dezoxiribonucleozide ca o nouă clasă de monomeri pentru sinteza stereocontrolată a fosforotioaților de oligotimidilil și oligodeoxicitidilil-// J. Amer. Chim. soc. - 2000. - T. 122 , nr. 10 . - S. 2149-2156 . doi : 10.1021 / ja991773u .
  70. ↑ Lebedev AV, Wickstrom E. Problema chiralității în oligonucleotidele P-substituite  //  Perspective in Drug Discovery and Design. - 1996. - Vol. 4 , nr. 1 . - P. 17-40 . - doi : 10.1007/BF02172106 .
  71. ↑ 1 2 Guzaev AP Reactivitatea 3H-1,2,4-ditiazol-3-tionelor și 3H-1,2-dithiole-3-tione ca agenți de sulfurare pentru sinteza oligonucleotidelor  (engleză)  // Tetrahedron Lett. - 2011. - Vol. 52 , nr. 3 . - P. 434-437 . - doi : 10.1016/j.tetlet.2010.11.086 .
  72. ^ Iyer RP, Egan W., Regan JB ,  Beaucage SL  . Chim. soc. - 1990. - Vol. 112 , nr. 3 . - P. 1253-1254 . - doi : 10.1021/ja00159a059 .
  73. ↑ Vu H., Hirschbein BL Sulfurarea fosfitului internucleotid cu disulfură de tetraetilthiuram. Sinteza oligonucleotidelor de fosforotioat prin chimia fosforamiditelor  (engleză)  // Tetrahedron Lett. - 1991. - Vol. 32 , nr. 26 . - P. 3005-3008 . - doi : 10.1016/0040-4039(91)80672-S .
  74. ↑ Efimov VA, Kalinkina AL, Chakhmakhcheva OG, Hill TS, Jayaraman K. Noi reactivi de sulfurare eficienti pentru prepararea analogilor de fosforotioat de oligodezoxiribonucleotide (ut) // Nucl. Acizi Res. - 1995. - T. 23 , Nr. 20 . - S. 4029-4033 . doi : 10.1093 / nar/23.20.4029 . — PMID 7479060 .
  75. ↑ Ito H., Ike Y., Ikuta S., Itakura K. Solid phase synthesis of polynucleotides. VI. Studii suplimentare asupra copolimerilor de polistiren pentru suportul solid   // Nucl . Acizi Res. - 1982. - Vol. 10 , nr. 5 . - P. 1755-1769 . doi : 10.1093 / nar/10.5.1755 .
  76. ↑ Tanaka T., Letsinger RL Metoda cu seringă pentru sinteza chimică în etape a oligonucleotidelor   // Nucl . Acizi Res. - 1982. - Vol. 10 , nr. 10 . - P. 3249-3259 . doi : 10.1093 / nar/10.10.3249 . — PMID 7099961 . Arhivat din original pe 6 mai 2022.
  77. ↑ Alvarado-Urbina G., Sathe GM, Liu WC, Gillen MF, Duck PD, Bender R., Ogilvie KK Automated synthesis of gene fragments   // Science . - 1981. - Vol. 214 , nr. 4518 . - P. 270-274 . - doi : 10.1126/science.6169150 .
  78. ↑ BioAutomation. Sintetizator de oligonucleotide ADN/ARN: MerMade . Data accesului: 11 decembrie 2012. Arhivat din original la 16 ianuarie 2013.
  79. ↑ BIOSSET (link inaccesibil) . Consultat la 11 decembrie 2012. Arhivat din original la 3 noiembrie 2012. 
  80. ↑ Azco Biotech Inc. Sintetizatoare Azco ADN/ARN (link indisponibil) . Preluat la 11 decembrie 2012. Arhivat din original la 15 septembrie 2011. 
  81. ↑ Boal JH, Wilk A., Harindranath N., Max EE, Kempe T., Beaucage SL Cleavage of oligodeoxyribonucleotids from controlled-pore glass supports and their rapid deprotection by gazeous   amines // Nucl . Acizi Res. - 1996. - Vol. 24 , nr. 15 . - P. 3115-3117 . doi : 10.1093 / nar/24.15.3115 . Arhivat din original pe 20 ianuarie 2016.
  82. ↑ Westman E., Strömberg R. Îndepărtarea protecției t-butildimetilsilil în sinteza ARN. Trihidrofluorura de trietilamină (TEA, 3HF) este o alternativă mai fiabilă la fluorură de tetrabutilamoniu (TBAF  )  // Nucl. Acizi Res. - 1994. - Vol. 22 , nr. 12 . - P. 2430-2431 . - doi : 10.1093/nar/22.12.2430 . — PMID 7518583 .
  83. ↑ Capaldi DC, Gaus H., Krotz AH, Arnold J., Carty RL, Moore MN, Scozzari AN, Lowery K., Cole DL, Ravikumar VT Synthesis of High-Quality Antisens Drugs. Adăugarea de acrilonitril la oligonucleotide de fosforotioat: caracterizarea și evitarea aductului   // Org . Proc. Res. dev. - 2003. - Vol. 7 , nr. 6 . - P. 832-838 . - doi : 10.1021/op020090n .
  84. ↑ Glen Research. Deprotejare - Volumul 5 - Deprotejarea pe coloană a oligonucleotidelor în solvenți organici . Data accesului: 11 decembrie 2012. Arhivat din original la 16 ianuarie 2013.
  85. ↑ Biosisteme aplicate. Evaluarea și izolarea oligonucleotidelor sintetice. Ghidul complet (2002). Consultat la 15 aprilie 2013. Arhivat din original pe 19 aprilie 2013.
  86. ↑ Evaluarea și izolarea oligonucleotidelor sintetice, 2002 , pp. 2-5-2-6.
  87. ↑ Evaluarea și izolarea oligonucleotidelor sintetice, 2002 , pp. 3-1-3-19.
  88. ↑ Evaluarea și izolarea oligonucleotidelor sintetice, 2002 , pp. 4-1-4-15.
  89. ↑ Krotz AH, Gaus H., Hardee GE Formarea aductilor de oligonucleotide în formulări farmaceutice // Dezvoltare și tehnologie farmaceutică. - 2005. - T. 10 , nr 2 . - S. 283-90 . - doi : 10.1081/PDT-54464 . — PMID 15926677 .
  90. ^ Willems A., Deforce DL, Van Bocxlaer J. Analysis of oligonucleotids using capilar zone electrophoresis and electrospray mass spectrometrie // Methods in Molecular Biology. - Springer, 2008. - T. 384. Electroforeza capilară. - S. 401-414. — ISBN 978-1-59745-376-9 . - doi : 10.1007/978-1-59745-376-9_14 .

Literatură

Lucrări originale majore

  • Caruthers MH Sinteza chimică a ADN-ului și a analogilor de ADN   // Acc . Chim. Res. - 1991. - Vol. 24 , nr. 9 . - P. 278-284 . doi : 10.1021 / ar00009a005 .
  • Letsinger RL, Mahadevan V. Sinteza în trepte a oligodeoxirribonucleotidelor pe un suport polimeric insolubil  //  J. Am. Chim. soc. - 1966. - Vol. 88 , nr. 22 . - P. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.

Recenzii

  • Burtscher H., Berner S., Seibl R., Mühlegger K. Nucleic Acids // Enciclopedia de chimie industrială a lui Ullmann. - Wiley, 2000. - doi : 10.1002/14356007.a18_001 .
  • Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Sinteza oligonucleotidelor // Chimie cuprinzătoare a produselor naturale . - Elsevier, 1999. - P. 105-152.
  • Reese CB Oligo- și poli-nucleotide: 50 de ani de sinteză chimică   // Org . Biomol. Chim. - 2005. - Vol. 3 , nr. 21 . - P. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .

Metode

Link -uri