Recombinarea V(D)J [1] , sau rearanjarea V(D)J [2] ( ing. Recombinarea V(D)J, rearanjarea V(D)J ), este un mecanism de recombinare somatică a ADN-ului care are loc în stadiile incipiente ale diferențierii limfocitelor și care conduc la formarea de secțiuni de anticorpi care recunosc antigenul și a receptorului celulelor T. Genele imunoglobulinelor ( în engleză Ig ) și a receptorilor de celule T ( în engleză TCR ) constau din segmente repetate aparținând la trei clase: V (din engleză variabilă ), D (din engleză diversity ) și J (din engleză .joining ) . În timpul rearanjamentului V(D)J, segmentele de gene, câte unul din fiecare clasă, sunt unite. Secvența combinată a segmentelor V(D)J codifică domeniile variabile ale fiecărui receptor sau lanțuri de anticorpi [2] .
O moleculă de anticorp (imunoglobulină) este un tetramer format din două lanțuri grele identice (lanțuri H) și două lanțuri ușoare identice (lanțuri L). Fiecare lanț are o regiune variabilă N-terminală (variabilă sau domeniu V) și o regiune constantă (constantă sau domeniu C) la capătul C-terminal . Domeniul variabil este implicat în recunoașterea antigenului , iar domeniul C este responsabil pentru funcțiile efectoare. După cum sugerează și numele, secvența de aminoacizi a domeniului V este variabilă, în timp ce domeniul C prezintă un conservatorism pronunțat . Variabilitatea maximă se manifestă tocmai în regiunea responsabilă de legarea antigenului [3] . Locul de legare a antigenului este format din domeniile V ale lanțurilor grele și ușoare (domeniile V H - și , respectiv, V L ) [4] . Lanțul L conține un domeniu C (notat C L ), iar lanțul H conține 3 sau 4 domenii, care sunt notate CH 1, CH 2, CH 3, CH 4. Domeniile C nu sunt implicate în recunoașterea antigenului și sunt necesare pentru interacțiunea cu receptorii celulelor imune , activarea sistemului complementului și a altor funcții efectoare [5] .
Spre deosebire de majoritatea genelor, imunoglobulina și genele receptorului celulelor T nu sunt prezente ca un întreg în linia germinativă și celulele somatice . Formarea unei singure gene care codifică domeniile V și C are loc printr-unul (în cazul lanțurilor uşoare) sau două (în cazul lanţurilor grele) acte de recombinare somatică. Domeniile V și domeniile C sunt codificate de segmente separate ale genei V și, respectiv, ale genei C și nu pot fi exprimate singure: în acest sistem, două „gene” codifică o singură polipeptidă - una ușoară sau grea. lanţ. Oricare dintr-o multitudine de segmente de genă V se poate conecta la oricare dintre mai multe segmente de genă C. Lanțurile ușoare se formează ca urmare a unui singur act de recombinare. Există două tipuri de lanțuri ușoare: κ și λ. Lanțul ușor λ este format prin recombinare între gena V λ și segmentul J λ C λ . Litera J este abreviată ca locul cu care este conectat segmentul V λ , adică reacția de conectare nu are loc direct între segmentele V λ - și C λ -, ci prin segmentul J λ . Acest segment codifică mai multe resturi de aminoacizi (a.o.) ale regiunii variabile și în gena formată prin recombinare, segmentul V λ -J λ este un singur exon care codifică întreaga regiune variabilă. În cazul unui lanț ușor de tip κ, lanțul este de asemenea asamblat din două segmente, totuși, după gena V κ , urmează un grup de cinci segmente J κ , care este separat de exonul C κ printr-un intron 2 la Lungime de 3 mii de perechi de baze . În timpul recombinării, segmentul V κ se poate uni cu oricare dintre segmentele J κ , iar exonul variabil intact constă în cele din urmă din segmentele V κ și J κ . Segmentele J κ situate la stânga segmentului J κ recombinant sunt îndepărtate, iar segmentele J κ din dreapta segmentului recombinant devin parte a intronului dintre exonii variabili și constanți [6] .
Lanțurile grele se formează ca rezultat nu a unuia, ci a două acte de recombinare, iar în formarea lor sunt implicate elemente precum gena VH , segmentul D și segmentul genei VHCH . Segmentul D este o secțiune de 2-13 a. o., separând secvențele care codifică segmentul VH și segmentul JH . Locul segmentelor D de pe cromozom este de asemenea situat între seturile de segmente V H și segmente J H. Combinația V H -DJ H are loc în două etape: mai întâi, unul dintre segmentele D este conectat la segmentele J H , iar apoi segmentul V H se recombină cu segmentul DJ H combinat . Secvența rezultată a trei elemente VH - DJH este co - exprimată cu gena CH , care este situată în dreapta lui VH - DJH și include patru exoni. La om, locusul segmentului D conține 30 de segmente D în tandem , urmat de un grup de 6 segmente JH . Cum se asigură că același segment D participă la evenimentele de recombinare DJ H și V H -DJ H este încă necunoscut. După denumirea elementelor individuale, procesul de asamblare a unui singur locus care codifică un lanț ușor sau greu a fost numit V(D)J-recombinare [7] .
Receptorul celulei T ( TCR ) este un heterodimer din două subunități : a și p (receptor TCRαβ) sau y și 5 (receptor TCRγδ), care codifică genele TCRA, TCRB, TCRG și respectiv TCRD. Deși secvențele de codificare a lanțului δ TCR sunt localizate în gena lanțului a, ele sunt de obicei considerate a fi un grup genetic distinct . Ca și în cazul imunoglobulinelor, receptorul celulelor T include domenii constante și gene C care le codifică, domenii V care codifică gene V și segmente J care separă grupuri de gene C și gene V (în TCRB și Genele TCRD sunt prezente și segmentele D). În timpul formării fiecăruia dintre cele patru lanțuri TCR posibile, apare și recombinarea V(D)J [8] . În cazul genelor TCRB și TRCD care conțin segmente D, recombinarea are loc în două etape (întâi între segmentele D și J, apoi între segmentele DJ și V), iar în cazul TCRA și TRCG, într-o singură etapă [9] .
Astfel, doar șapte loci genici sunt supuși rearanjarii V(D)J: lanțul greu al imunoglobulinei (IgH), lanțurile ușoare κ și λ, precum și patru gene receptorilor celulelor T care codifică lanțurile α, β, γ, δ: TCRA, TCRB, TCRG și, respectiv, TCRD. Segmentele D sunt prezente numai în gena lanțului greu al imunoglobulinei, TCRB și TCRD [10] .
Genele V ale tuturor lanțurilor polipeptidice implicate în recunoașterea antigenului suferă o rearanjare, dar nu în același timp, ci secvenţial. În celulele B , genele lanțului greu sunt rearanjate mai întâi, iar apoi genele lanțului ușor (lanțurile uşoare de tip K sunt rearanjate mai întâi, apoi lanțurile uşoare de tip λ). În celulele T , în timpul formării genelor TCRαβ, genele lanțului β și apoi α sunt rearanjate mai întâi. În cazul TCRγδ, rearanjarea genelor domeniilor variabile ale lanțurilor γ și δ are loc aproape simultan [11] .
Recombinarea V(D)J se finalizează numai în celulele T și B sub influența semnalelor de diferențiere din mediul extern. Etapele inițiale de rearanjare sub formă de recombinare DJ pot apărea și în celulele care nu sunt legate de celulele T și B, de exemplu, ucigașii naturali , care sunt aproape ca origine de celulele T [12] . Mecanismul molecular al recombinării V(D)J a tuturor celor șapte loci ai imunoglobulinelor sau receptorilor celulelor T este identic [13] . Secvența reacțiilor de recombinare V(D)J este descrisă în secțiunea anterioară și mecanismele moleculare ale recombinării V(D)J vor fi, de asemenea, descrise aici.
Recombinarea are loc la secvențele semnal ADN imediat adiacente segmentelor de gene. Aceste secvențe conservate sunt numite secvențe semnal de recombinare ( în engleză recombination signal sequence , RSS) și constau din șapte nucleotide - 5'-CACAGTG-3' ( heptamer ), urmate de o secvență de 12 sau 23 de nucleotide - un distanțier și mai mult un bloc conservator de nouă nucleotide - 5'-ACAAAAACC-3' (nonamer). Secvența distanțierului poate varia, dar lungimea este conservatoare și corespunde unei (12 nucleotide) sau două (23 de nucleotide) spire a dublei helix ADN Rearanjarea are loc numai între două RSS-uri, dintre care unul are un distanțier de 12 perechi de baze (bp), celălalt are un distanțier de 23 bp, așa-numita „regula de recombinare 12/23”. Acest model de structură RSS determină secvența de recombinare corectă: de exemplu, locusul IGH are un RSS de 23 bp. la capătul 3' al fiecărui segment V, RSS 12 bp lungime. la capetele 3’ și 5’ ale fiecărui segment D și un RSS de 23 bp. la capătul 5' al fiecărui segment J. Astfel, rearanjarea VJ a acestui locus nu este posibilă. Aranjamentul secvențelor consens în segmentele V sau J poate fi oricare, adică diferiți distanțieri servesc doar pentru a preveni recombinarea segmentului V sau J cu același segment și nu poartă informații semnificative [14] .
Proteinele RAG1 și RAG2 ( genele de activare a recombinării ) sunt necesare și suficiente pentru introducerea rupturii ADN-ului în timpul recombinării V(D)J . Șoarecii care nu au genele RAG1 și RAG2 au doar celule T și B imature, deoarece nu sunt capabili să formeze anticorpi funcționali și receptori pentru celulele T. RAG1 recunoaște secvențele de semnal cu distanțiere corespunzătoare de 12 sau 23 bp. și recrutează RAG2 în complexul de reacție. Secvență de semnal de 9 p. este locul recunoașterii primare și secvența de 7 pb. indică locația tăieturii. Ca urmare a dimerizării RAG1 și RAG2, secvențele asociate acestora se apropie una de cealaltă, ceea ce este facilitat și de interacțiuni complementare între secvențele semnal, care sunt posibile datorită palindromicității lor . Heterodimerul HMG1/2 participă, de asemenea, la convergența secvențelor legate de RAG1 și RAG2. Complexul RAG1/2 introduce o singură ruptură de catenă la fiecare dintre cele două regiuni care vor fi unite prin recombinare. La capetele fiecăreia dintre cele două rupturi monocatenare, există o grupare fosfat 5'-terminală și o grupare hidroxil 3'-terminală (3'-OH). 3'-OH care este adiacent segmentului de codificare atacă legătura fosfodiester în poziția corespunzătoare de cealaltă parte a duplexului ADN. Ca urmare a acestei reacții, se formează un ac de păr la locul fiecărei rupturi cu un singur catene , în care capătul 3’ al uneia dintre cele două catene ale helixului ADN este legat covalent de capătul 5’ al al doilea fir al duplexului. Accele de păr de la capetele segmentelor de codificare sunt recunoscute de un heterodimer al proteinelor Ku70 și Ku80 , iar proteina Artemis deschide acele de păr. În plus, capetele segmentelor de codificare sunt conectate prin același mecanism ca și în conexiunea neomoloagă a capetelor în timpul reparării ADN-ului . Dacă are loc o ruptură a lanțului ADN în apropierea acului de păr, atunci se formează o regiune lungă monocatenară la capătul segmentului de codificare. În continuare, se completează un lanț complementar acestuia și se introduc câteva nucleotide suplimentare în regiunea de la capătul segmentului de codificare, care formează o secvență care este palindromică față de original (de aceea se numesc P-nucleotide din engleză ). palindromic ). Nucleotide suplimentare dintre segmentele de codificare pot proveni, de asemenea, dintr-un alt proces. Enzima deoxinucleotidiltransferaza terminală (TdT) introduce o cantitate mică (până la 20, de obicei mai puțin de 10) de nucleotide aleatorii suplimentare (N-nucleotide) între capetele segmentelor, după care acestea sunt legate într-o cale de unire a capetelor neomoloage. [15] . Secțiunea de tăiere care conține secvențele de semnal RSS se închide pentru a forma o structură în formă de inel cunoscută sub numele de cerc de excizie de recombinare (REC din engleză. Cercul de excizie de recombinare ) [9] .
Reunirea capetelor segmentelor codificatoare are loc prin mecanismul de unire a capetelor neomolog, cu participarea enzimelor ADN ligaza IV, protein kinaza dependentă de ADN , proteinele Ku70/Ku80, XRCC4 și factorul de unire a capetelor neomolog 1 [16] . Aceasta completează ansamblul genei care codifică lanțul de imunoglobuline sau TCR. Protein kinaza dependentă de ADN este implicată în activarea proteinei care rezolvă ac de păr Artemis prin fosforilare [17] . Combinația de proteine RAG1, RAG2, protein kinaza dependentă de ADN, ADN ligaza IV, TdT, HMG1/2 și Ku70/Ku80 se numește complexul de recombinare V(D)J [18] .
Datorită recombinării V(D)J, în corpul unei vertebrate este creată o varietate enormă de anticorpi . Un singur locus al lanțului greu poate da naștere la mai mult de 108 combinații diferite de VH - JH - CH . Locii de lanț ușor pot da naștere la aproximativ un milion de lanțuri de tip λ sau κ recombinate [19] . Întregul spectru de anticorpi din sânge în 2008, George Church a propus să numească termenul V(D)J-th [20] .
În unele cazuri, recombinarea V(D)J poate duce la inversiuni sau ștergeri . Deci, uneori în loci de lanțuri ușoare de tip λ, segmentul V λ are o orientare pe cromozom opusă orientării locusului J λ -C λ , iar ruperea și reunirea în acest caz va duce la inversarea locului șters cu secvențe semnal în loc de excizia acestuia din cromozom (deleție) . Consecințele funcționale ale inversării pentru sistemul imunitar nu diferă de cele ale deleției. Recombinarea prin inversare are loc la loci TCR, lanțuri grele și lanțuri uşoare de tip κ [21] .
Când rearanjarea unei anumite gene V are succes, expresia genelor RAG se oprește și gena de pe cromozomul omolog rămâne nerearanjată și nu funcționează. Aproximativ două treimi din evenimentele eșuate de recombinare V(D)J se datorează deplasării cadrelor . Dacă rearanjarea eșuează, recombinarea V(D)J începe pe cromozomul omolog și, dacă este finalizată cu succes, gena de pe cromozomul omolog rămâne singura funcțională, adică are loc excluderea alelică . În 45% din cazuri, recombinarea V(D)J eșuează pe ambii cromozomi ai limfocitelor și moare prin apoptoză . În cazul αβ-TCR, când rearanjarea genei lanțului α eșuează, procesul de editare repornește și gena RAG este re-exprimată. Recombinarea continuă cu participarea segmentului Vα, care nu a fost excizat din cromozom și nu a intrat în inelul de excizie. Procesul poate fi repetat până când este generată o genă funcțională care codifică lanțul ușor. În timpul sarcinii sau când o celulă T recunoaște un auto- antigen , poate apărea editarea genei lanțului α . Dacă gena lanțului α este editată, care se află în configurația liniei germinale pe al doilea cromozom al unei perechi de omologi, atunci poate apărea o situație care încalcă regula de excludere alelică: într-o celulă T vor exista două TCR cu același lanțuri β, dar lanțuri α diferite [22] .
Încălcările recombinării V(D)J conduc la dezvoltarea stărilor de imunodeficiență . În sindromul de imunodeficiență combinat sever , nivelul recombinării V(D)J în loci care codifică imunoglobuline și receptorii celulelor T este foarte scăzut. Sindromul de imunodeficiență combinată sever este cauzat de mutații care produc proteine de recombinare V(D)J nefuncționale: RAG1, RAG2, Artemis sau protein kinaza dependentă de ADN [23] [17] .
Pe baza datelor privind prezența domeniilor constante și variabile în molecula de imunoglobuline, Dreyer și Bennett au sugerat în 1965 că două gene, V și C, sunt implicate în construcția unui singur lanț greu sau ușor de imunoglobuline [24] . În 1976, Suzumi Tonegawa a început o serie de experimente și a arătat că genele care codifică anticorpi suferă rearanjamente care creează o mare varietate de anticorpi [25] . În 1987, Tonegawa a primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină pentru descoperirea mecanismelor diversităţii anticorpilor [26] .
| Sistemul imunitar adaptiv al limfocitelor și complementul | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| limfoid |
| ||||||||
| Limfocite | |||||||||
| Substanțe | |||||||||