piRNA ( piwi -interacting ARN, piRNA, piwiRNA , în unele surse se găsește ca piRNA [1] ) este cea mai mare clasă de ARN necodificant mic exprimat în celulele animale [2] ; se găsesc în complexe cu proteine din familia Piwi , pentru care și-au primit numele. piRNA-urile sunt de obicei mai lungi decât miARN -urile și micile ARN interferente și au o lungime de 26-32 de nucleotide [3] ; în plus, spre deosebire de miARN-uri, nu sunt atât de conservatoare [2] . Proteinele Piwi aparțin grupului mare de proteine Argonaute și sunt exprimate aproape exclusiv în celulele germinale ; sunt necesare pentru menținerea celulelor stem din linia germinativă , spermatogeneză și reprimarea elementelor transpozabile . Complecșii Piwi cu piRNA nu sunt doar implicați în tăcere retrotranspozonilor și a altor elemente genetice la nivel post- translațional , dar au și alte efecte nedescrise în mare măsură, de exemplu, epigenetice [4] .
Rămâne neclar cum se formează piRNA-urile, dar s-au propus potențiale metode de cercetare pentru această întrebare și s-a descoperit că unele moduri de formare a acestora diferă de cele ale miARN-urilor și ale micilor ARN interferențe. În același timp, unii ARN-uri mici necodificatori din alt grup, rasiRNA , sunt considerați ca aparținând piRNA-urilor [3] [5] .
Numărul de piRNA detectate este de aproximativ 50 mii la mamifere și 13 mii la Drosophila melanogaster [ 6] , ceea ce este semnificativ mai mare decât numărul de ARN-uri mici cunoscute din alte clase. Deoarece o parte semnificativă a piRNA, în special la mamifere, nu este asociată cu elemente transpozabile, se poate presupune că acestea îndeplinesc și alte funcții care nu au fost încă descrise [3] .
piRNA-urile au fost descoperite în 2006 [3] .
PiRNA-urile au fost găsite atât la vertebrate , cât și la nevertebrate și, deși modelele de biogeneză și tipurile de interacțiune cu ținte pot diferi între specii, există o serie de trăsături conservate comune tuturor piRNA. Nu au fost găsite motive pronunțate structurii secundare [7] în piRNA , lungimea lor este de 26–32 nt, iar în 80–90% din cazuri atât la vertebrate, cât și la nevertebrate, prima nucleotidă de la capătul 5’ este uridină (U). Nematodul Caenorhabditis elegans are o grupare fosfat la capătul 5’ și 2’-O- metilare la capătul 3’ [8] . Această modificare a fost identificată și la Drosophila [9] , peștele zebră [10] , șoareci [11] și șobolani [10] . O grupare fosfat la capătul 5’ se găsește și în piRNA-urile de mamifere [3] . Semnificația acestei modificări nu a fost încă clar stabilită, dar se presupune că crește stabilitatea piRNA [3] [10] .
La șoareci, familia Piwi include trei proteine: Mili, Miwi și Miwi2 [3] ; la om, HIWI (sau PIWIL1), HILI (sau PIWIL2), HIWI2 (sau PIWIL4) și HIWI3 (sau PIWIL3) [12] .
La mamifere, aproximativ 17% din genele piARN corespund unor secvențe repetitive , inclusiv elemente transpozabile. Trebuie remarcat faptul că numărul de ARNpi care corespund repetărilor este mai mic decât proporția de repetări din genom . Astfel, la rozătoare, aceste rapoarte sunt de 17 și, respectiv, ~42%. Alte piRNA-uri sunt codificate de gene unice, cu gene care codifică piRNA situate în grupuri în întregul genom. 90% dintre astfel de clustere sunt localizate în zone care nu conțin gene adnotate sau repetări, dar uneori pot fi localizate în introni și exoni [3] . Astfel, în timp ce la D. melanogaster și vertebrate aceste grupuri sunt localizate în zonele în care genele care codifică proteine sunt absente, la C. elegans genele piRNA sunt localizate printre genele care codifică proteine [5] [8] [13] . Fiecare astfel de cluster poate codifica de la 10 la multe mii de piRNA, iar dimensiunea sa poate varia de la 1 la 100 kilobaze [14] . Uneori, grupurile de piRNA sunt situate unul lângă altul, dar codificate de diferite catene; aceasta poate indica transcrierea bidirecțională de la un promotor comun . Detectarea și adnotarea pe scurt a clusterelor de piRNA din genomi se realizează folosind metode bioinformatice , care devin din ce în ce mai complicate [15] . Deși prezența grupurilor de gene piRNA este foarte conservată între specii , nu același lucru se poate spune despre secvențele acestor gene [16] . De exemplu, deși cele mai mari grupuri de piRNA de rozătoare au ortologi umani , asemănarea secvenței nu este observată în acest caz [3] .
Anterior, se credea că la mamifere, piRNA și proteinele Piwi se găsesc doar în testicule [3] . Cu toate acestea, până acum s-a stabilit că un sistem specific piRNA este prezent și în ovocitele de mamifere [17] . În plus, s-a demonstrat că o genă suplimentară a proteinei Piwi, PIWI-LIKE 3 (PIWIL3) , este exprimată în ovocitele bovine în timpul meiozei . În ciuda acestui fapt, piRNA-urile mamiferelor par să funcționeze numai la bărbați [18] . La nevertebrate, piRNA-urile au fost identificate atât în celulele germinale masculine, cât și în cele feminine [10] .
La nivel celular, piRNA-urile au fost găsite atât în nucleu , cât și în citoplasmă , sugerând că piRNA-urile pot funcționa în ambele [5] și astfel au efecte multiple [19] .
Nivelul de expresie al piRNA se modifică în timpul spermatogenezei. Ele încep să fie detectate în pachiten ( profaza I a diviziunii meiotice ) în timpul diviziunii spermatocitelor diploide prin meioză (deși formarea piARN începe chiar și în celulele prepachitizate [20] ), totuși, în timpul formării spermatidelor haploide , conținutul de piRNA din ele scade brusc, iar în spermatozoizii maturi , ei, judecând după jur, lipsesc [3] .
Mecanismele de formare a piRNA nu sunt încă pe deplin înțelese, deși au fost propuse câteva mecanisme posibile. În cazurile în care genele piARN cad în exoni, piARN-urile corespund numai catenei de ARNm sens (sens-) , deci sunt formate dintr-o singură catenă de ADN și este probabil să fie derivați ai transcriptelor precursoare primare lungi. Această ipoteză este în concordanță cu datele privind prezența EST -urilor specifice testiculelor și ARNm care corespund locilor piRNA . În plus, nu au fost găsite structuri secundare dezvoltate caracteristice pri-miARN-urilor în clusterele piRNA. Prin urmare, procesarea piRNA pare să fie diferită de microARN și procesarea ARN-ului mic de interferență. Absența precursorilor dublu catenar, care sunt caracteristici, în special, miARN-urilor, este evidențiată de prezența numai secvențelor simț în unele piRNA-uri unice [3] .
La Drosophila și la șoareci, în procesarea piRNA se pot distinge două etape: procesarea primară și ciclul „ping-pong” (bucla de amplificare) [20] .
După cum s-a menționat mai sus, piRNA-urile sunt formate din transcrieri precursoare lungi. La Drosophila, transcrierile primare sunt scurtate la ARN-uri mici asemănătoare piRNA. Factorii implicați în acest proces sunt încă puțin înțeleși, dar studii recente au arătat că este posibil ca capătul 5’ al unor astfel de ARN-uri asemănătoare piRNA să fie format de endonucleaza Zucchini . La șoareci, omologul lui Zucchini este proteina MitoPLD, care are și proprietăți de endonuclează. După aceea, ARN-urile asemănătoare piRNA sunt legate de proteinele Piwi, după care capătul lor 3’ este scurtat de o endonuclează încă nedescrisă, iar ARN-urile asemănătoare piARN-ului capătă dimensiuni corespunzătoare piARN-urilor primare. Este posibil ca complexul proteic Hsp83/Shu să joace un rol important în încărcarea piRNA pe proteinele Piwi. În plus, piRNA-urile sunt 2'-O-metilate de către complexul HEN1/Pimet [20] .
PiRNA care a fost supus procesării primare este într-o stare asociată cu proteinele Piwi. Astfel de ARNpi primari sunt ARNpi antisens care sunt complementare transcrierilor elementelor transpozabile. La Drosophila, familia de proteine Piwi este reprezentată de trei proteine: Piwi, Aubergine (Aub) și Ago3, dar numai proteinele Piwi și Aub leagă piRNA-urile primare. Complexele Piwi cu piARN sunt transferate în nucleu și nu participă la ciclul „ping-pong” care are loc în citoplasmă , ci participă la tăcere nucleară. PiRNA-urile asociate cu Aub leagă transcriptele elementelor genetice mobile în mod complementar. Aub, ca și alte proteine din grupul Argonaute, este capabil să taie legătura fosfodiesterului din ARN-ul țintă situat vizavi de nucleotidele 10 și 11 ale ARN-ului ghid (în acest caz, piRNA-urile primare). Ca rezultat al ruperii, se formează două fragmente ale transcriptului elementului mobil, în unul dintre care capătul 5’ este la 10 nucleotide distanță de capătul 5’ al piARN-ului primar. Acest fragment, un piARN secundar, spre deosebire de piARN primar, nu este complementar transcriptului elementului mobil și este un piARN sens. Deoarece cel mai adesea prima nucleotidă din piRNA-urile primare este uridina, nucleotida adenină este cel mai adesea localizată în a 10-a poziție de la capătul 5’ în piRNA-urile secundare . Mecanismul de procesare a capătului 3’ al piRNA-urilor secundare este încă neclar. PiARN-ul secundar leagă proteina Ago3 și este direcționat pentru a tăia transcriptul precursorului piRNA primar, din care piARN-ul antisens este excizat. Astfel de piARN antisens pot fie să reducă la tăcere elementele transpozabile, fie să direcționeze formarea de noi piARN cu sens. Astfel, ciclul de ping-pong combină procesarea piRNA și tăcere citoplasmatică a elementelor mobile la nivel de transcriere. De asemenea, face posibilă îmbunătățirea tăcere datorită formării de noi piRNA antisens ca răspuns la expresia crescută a elementelor transpozabile [3] . La Drosophila, ciclul „ping-pong” poate implica nu numai ARNpi primari, ci și ARNpi moștenite de la mamă. Ciclul de ping-pong al Drosophila este numit heterotipic deoarece implică 2 proteine Piwi diferite, Aub și Ago3 [20] .
La șoareci, piRNA-urile primare leagă proteinele Mili și Miwi, în timp ce piRNA-urile secundare leagă proteina Miwi2. PiRNA-urile asociate cu Miwi sunt implicate în tăcere citoplasmatică, dar țintele lor sunt în mare parte necunoscute. PiRNA-urile primare asociate Mili sunt implicate în ciclul ping-pong. PiRNA-urile secundare formate în acest ciclu se leagă de Miwi2, iar complexul piRNA cu Miwi2 este trimis la nucleu, unde participă la tăcere nucleară. Ciclul de ping-pong la șoarece este numit homotipic deoarece implică o proteină Piwi, Mili. Complexul proteic HSP90/FKBP6 joacă un anumit rol în formarea piRNA-urilor secundare care se leagă de Miwi2. 2'-O-metilarea piRNA-urilor secundare este asigurată de complexul HEN1/Pimet [20] .
În Drosophila, în celulele somatice ale gonadelor (de exemplu, în celulele foliculare), proteinele Piwi sunt, de asemenea, exprimate și se leagă de piRNA-urile primare, cu toate acestea, proteinele Aub și Ago3 sunt exprimate aici la un nivel scăzut și nu sunt suficiente pentru a transporta scoaterea ciclului „ping-pong” [20] .
Aparent, un mecanism similar de reprimare a elementelor mobile există la peștele zebra [3] . Semne ale prezenței mecanismului „ping-pong” au fost găsite la cele mai primitive animale - bureți și cnidari , ceea ce indică faptul că mecanismul „ping-pong” a apărut în cele mai timpurii ramuri ale Metazoarelor și este un mecanism conservator pentru reprimare. a elementelor mobile [3] [21] .
Alte proteine care nu aparțin grupului Piwi participă și ele la biogeneza piRNA. În special, acestea sunt unele proteine aparținând superfamiliei Tudor (TDRD). Acestea conțin domeniul Tudor , care asigură legarea proteinei TDRD de un alt substrat proteic datorită prezenței reziduurilor de dimetilarginină simetrice sau asimetrice în substrat. Proteinele Piwi au reziduuri simetrice de dimetilarginină în apropierea capătului N-terminal , astfel încât proteinele TDRD sunt capabile să se lege de ele și să participe la tăcere ARN . Începând cu 2011, 11 proteine TDRD implicate în biogeneza piRNA au fost identificate la Drosophila și 7 astfel de proteine TDRD au fost identificate la șoareci [20] .
De exemplu, muștele mutante în proteina TDRD Tud s-au dovedit a fi în concordanță fenotipic cu mutanții din proteina Aub. Proteina Tud conține 11 domenii Tudor și este capabilă să se lege atât de Aub, cât și de Ago3 prin reziduuri simetrice de dimetilarginină, servind astfel ca o „platformă” pentru ciclul „ping-pong”. La mutanții Tud, proteinele Aub și Ago3 se leagă de piRNA mai activ decât la muștele de tip sălbatic , ceea ce a cauzat abateri de la fenotipul normal [20] .
Sunt cunoscute, de asemenea, mai multe proteine care sunt implicate în biogeneza piRNA și nu sunt legate nici de proteinele Piwi, nici de TDRD. Astfel, la Drosophila, un astfel de efect a fost demonstrat pentru următoarele proteine: Vasa (Vas), Maelstrom (Mael), Armi, Zuc, Squash (Squ) și Shu, toate acestea, cu excepția Squ, au omologi în soareci. Majoritatea acestor factori sunt implicați în mecanismul „ping-pong” [20] .
S-a stabilit că C. elegans are piRNA, dar îi lipsește mecanismul „ping-pong” [22] . Cu toate acestea, studiile recente ale biogenezei piRNA la C. elegans au aruncat parțial lumină asupra întrebării cum exact sistemul de apărare mediat de piRNA împotriva elementelor mobile parazitare recunoaște „sine” și „străin”, precum sistemul imunitar [20] .
PiRNA- urile C. elegans au o lungime de 21 de nucleotide și sunt codificate de două grupuri de pe cromozomul IV, situate separat de genele care codifică proteine. La o distanță de ~42 de nucleotide în fața fiecărui cluster, există secvența CTGTTTCA, aparent necesară pentru transcrierea clusterului de către ARN polimeraza II. PiRNA-urile sintetizate se leagă de proteina Piwi PRG-1. Complecșii piARN rezultați cu scanarea PRG-1 pentru transcrieri străine și complementaritatea incompletă (până la 4 nepotriviri) este suficientă pentru legarea la transcript. și declanșează formarea de ARN polimeraze dependente de ARN, care asigură formarea și amplificarea ARN-urilor interferente mici specifice (22G-ARN). Acestea din urmă se leagă de proteina WAGO, o proteină specifică C. elegans din grupul Argonaute . În citoplasmă, aceste complexe asigură silenciarea genelor la nivel de ARNm, distrugând transcriptele străine, în timp ce în nucleu blochează elementele transpozabile la nivel de transcripție [20] .
Recunoașterea „propriilor” și „străinilor” și protecția propriilor transcrieri împotriva distrugerii, aparent, se realizează la mai multe niveluri:
Pentru capacitatea de a reduce la tăcere elementele mobile și de a proteja genomul de ele, piRNA-urile au fost numite „gardienii genomului” [20] . Aparent, la mamifere, activitatea piRNA pentru tăcere transpozonului este deosebit de importantă în timpul dezvoltării embrionului ; în plus, atât la om, cât și la C. elegans sunt necesare pentru spermatogeneză [23] [24] . Mutațiile care perturbă sistemul de tăcere mediat de piRNA al elementelor transpozabile la șoarecii masculi reduc fertilitatea sau chiar conduc la sterilitate [3] [25] . De asemenea, este posibil ca unele boli ale sistemului reproducător uman, cum ar fi azoospermia, să fie cauzate de defecte ale sistemului piRNA [20] .
S-a remarcat o anumită acțiune a piRNA-urilor asupra unor metiltransferaze , care efectuează metilarea necesară recunoașterii și atenuării transpozonilor, dar această relație este încă puțin înțeleasă [23] .
piRNA-urile pot fi transmise matern, iar efectele epigenetice ale unei astfel de moșteniri materne au fost demonstrate la Drosophila [13] . Activitatea piRNA-urilor specifice în procesele epigenetice necesită, de asemenea, interacțiunea piRNA-urilor cu proteinele Piwi, HP1a și alți factori [6] . Este posibil ca piRNA-urile să fie implicate în reglarea epigenetică a carcinogenezei [20] .
La gasteropodul Aplysia ( iepure de mare ), s-a demonstrat că piRNA-urile conținute în neuronii SNC suprimă expresia genei CREB2 , un represor al memoriei , prin inducerea metilării ADN-ului în regiunea sa și asigurând astfel funcționarea memoriei. În plus, piRNA-urile au fost găsite recent în neuronii hipocampali de șoarece . Probabil, acești piRNA sunt implicați în formarea spinilor dendritici [20] .
Cele mai mari progrese în studiul piARN-urilor au fost realizate folosind tehnici de secvențiere specifice, cum ar fi Solexa și 454. Cu acestea, populațiile de ARN eterogene și complexe, cum ar fi piRNA-urile, pot fi analizate. Dimensiunea mică a acestor ARN creează anumite dificultăți în exprimarea și amplificarea lor artificială , totuși, pentru a le depăși, au fost dezvoltate tehnici speciale bazate pe reacția în lanț a polimerazei [26] [27] .
| Tipuri de ARN | |
|---|---|
| Biosinteza proteinelor | |
| procesarea ARN |
|
| Reglarea expresiei genelor |
|
| elemente de reglare cis | |
| Elemente parazite | |
| Alte |
|
| Tipuri de acizi nucleici | ||||
|---|---|---|---|---|
| Baze azotate | ||||
| Nucleozide | ||||
| Nucleotide | ||||
| ARN | ||||
| ADN | ||||
| Analogii | ||||
| Tipuri de vectori |
| |||
| ||||