CRISPR

Sistemele de tip III sunt împărțite în două subtipuri: III-A și III-B. Ele se caracterizează prin prezența proteinei Cas10, cea mai mare subunitate a complexului efector Csm (în cazul subtipului III-A) și Cmr (în cazul subtipului III-B). În plus, toate sistemele de tip III codifică o proteină Cas5 și, de regulă, mai multe proteine ​​Cas7 paraloge [32] . Ambele subtipuri sunt caracterizate prin utilizarea ortologului Cas6 pentru procesarea pre-crARN, deși enzima de procesare nu este întotdeauna o componentă stabilă a complexului efector corespunzător (ca în sistemele de tip I). În 2008, s-a demonstrat că sistemul III-A al Staphylococcus epidermidis funcționează cu ținte ADN, iar în 2009, sistemul III-B al lui Pyrococcus furiosus  funcționează cu ARN. Pentru recunoașterea cu succes a țintei, sistemele III-A și III-B nu necesită prezența unui motiv PAM [14] .

Studiile suplimentare ale sistemelor de tip III au dezvăluit noi mistere în specificitatea substratului subtipurilor III-A și III-B. Astfel, s-a dovedit că sistemul III-A al S. epidermidis poate funcționa numai cu protospacer transcrise. În plus, s-a dovedit că complexele Csm ale S. thermophilus și Thermus thermophilus au activitate latentă de degradare a ARN-ului și introduc pauze în ARN la fiecare 6 nucleotide. Aceeași activitate a fost demonstrată și pentru complexele Cmr. Sistemul III-A al S. epidermidis nu numai că distruge transcrierile sintetizate, ci și taie ADN-ul țintă într-o manieră dependentă de transcripție, în detrimentul reziduurilor specifice de aminoacizi Cas10 care nu sunt asociate cu recunoașterea țintei. Hidroliza ARN mediată de complexele Csm și Cmr este catalizată nu de proteina Cas10, ci de subunitățile Csm3 și, respectiv, Cmr4. Astfel, sistemul III-A poate degrada atât ADN-ul, cât și ARN-ul; se presupune că activitatea de degradare a ARN-ului bine descrisă a sistemelor III-B este completată de capacitatea de a degrada ADN-ul [14] .

Deoarece sistemele de tip III nu necesită prezența PAM în ținte, în cazul lor trebuie să existe un mecanism diferit de cel al sistemelor de tip I pentru a distinge între ADNd sine și străin. În cazul complexului Csm, crRNA este complementar nu numai cu distanțierul CRISPR, ci și cu repetarea adiacentă. Astfel, la legarea de molecula țintă, crRNA se va lega doar de protospacer, iar la legarea de ADN-ul celulei, se va lega și de repetiția vecină, pe baza căreia sistemul III poate distinge ADN-ul celular de cel străin. Interesant, în sistemele de tip III, ADN-ul este tăiat foarte aproape de locurile în care bazele corespunzătoare ale crRNA și ADN-ul țintă nu sunt împerecheate. Practic nu se știe nimic despre mecanismele de achiziție de noi distanțiere în sistemele de tip III [14] .

Pe lângă subtipurile III-A și III-B recunoscute în mod obișnuit, în 2015 s-a propus să se distingă și subtipurile III-C și III-D, care apar în unele arhei. În sistemele de tip III-C, proteina Cas10 prezintă inactivarea domeniului ciclază ; în plus, secvența sa de aminoacizi diferă semnificativ de cea a sistemelor Cas10 III-A și III-B. În sistemele III-D, Cas10 nu are un domeniu HD; în plus, există o genă unică csx10 similară cu cas5 . Ambele sisteme III-C și III-D nu au genele cas1 și cas2 [ 32 ] .

În februarie 2016, au apărut informații că, în unele bacterii cu sisteme CRISPR-Cas de tip III (de exemplu, bacteria marina Marinomonas mediterranea ), în locul proteinei obișnuite Cas1, o proteină himerică Cas1-RT reticulata cu funcții de revers transcriptază . Datorită prezenței unei astfel de proteine, o bacterie se poate integra în genomul său distanțieri formați din genomi patogeni cu genomi ARN prin revers transcripție [36] .

S-a descoperit că sistemele de tip III, în special Cas10, produc mesageri secundi oligoadenilați ciclici, transformând ATP într-un produs ciclic care activează alosteric Csm6, care apoi ajută la degradarea ARN-ului viral [37] .

Sisteme de tip II

Sistemele CRISPR-Cas de tip II se deosebesc datorită bazei lor genetice neobișnuite și a mecanismelor moleculare. În special, complexele multiproteice care procesează crARN în sistemele de tip I și III sunt înlocuite în sistemele de tip II cu o singură proteină, Cas9, care este implicată în toate cele trei etape fundamentale ale acestui sistem. Astfel, sistemele de tip II sunt cel mai simplu tip de sistem CRISPR-Cas [32] . Mai mult, elemente suplimentare unice pentru sistemele de tip II sunt implicate în biogeneza crRNA. Sistemele de tip II se găsesc numai în bacterii și dintre tipurile I, II și III sistemele sunt cele mai puțin comune. Cu toate acestea, sistemele de tip II sunt cele care și-au găsit aplicație ca instrument de editare a genomilor [14] .

Sistemele de tip II sunt împărțite în trei subtipuri pe baza prezenței și secvențelor genelor cas asociate : II-A, II-B și II-C. Pe lângă genele cas1 și cas2 , care sunt comune tuturor sistemelor de tip I–III, sistemele de tip II au o genă cas9 suplimentară , care codifică endonucleaza Cas9. Cas9 este implicat în achiziția de noi distanțieri, acumularea crARN și interferența. În plus, sistemele II-A conţin gena csn2 , al cărei produs proteic este implicat în achiziţionarea distanţierilor. În sistemele II-B, această genă este înlocuită cu gena cas4 , iar sistemele II-C nu au nici csn2 , nici cas4 . Lungimea Cas9 variază în diferite subtipuri, iar sistemele II-C, de regulă, sunt caracterizate de cele mai scurte ortologi [14] . Partea centrală a Cas9, care este alcătuită din domeniul nuclează și clusterul bogat în arginină caracteristic acestei proteine, este cel mai probabil codificată de gene derivate din elemente genetice mobile care nu sunt în niciun fel asociate cu CRISPR. Având în vedere similitudinea semnificativă a secvențelor de aminoacizi dintre Cas9 și omologii săi, care nu sunt asociate cu sistemele CRISPR-Cas, Cas9 nu poate fi luată în considerare în sensul deplin al proteinei semnături a sistemelor de tip II. Cu toate acestea, poate fi considerat un semn distinctiv al acestor sisteme [32] .

Biogeneza crRNA în sistemele de tip II are o serie de caracteristici unice. În special, necesită procesarea de către RNaza III și legarea ARN-urilor CRISPR trans -codificate specifice (tracrRNAs) la pre-crARN . TracrARN conține o regiune complementară regiunii crARN care a fost transcrisă din repetarea CRISPR. În timpul procesării ARNcr, tracARN se leagă de ARNcr care nu au fost încă excizate în pre-ARNcr, rezultând în formarea de crARN matur. Complexul matur crRNA-tracrRNA-Cas9 rezultat conține un ARNcr scurt în care 20-24 de nucleotide sunt complementare capătului 3’ al distanțierului și 20-24 de nucleotide sunt complementare capătului 5’ al repetiției. Primul pas în procesarea pre-crARN are loc în regiuni complementare repetărilor CRISPR; ca urmare, se formează capătul 3’ al ARNcr. Trunchierea ulterioară la capătul 5’ de către nucleaze necunoscute are loc în secvențele corespunzătoare distanțierilor CRISPR. Acumularea crRNA în celule necesită proteina Cas9, deși nu se știe dacă acest lucru se datorează implicării lui Cas9 în procesarea crARN, stabilizarea post-procesare a crRNA de către Cas9 sau ambele [14] .

Complexul crRNA-tracrRNA-Cas9 recunoaște ADN-urile țintă care sunt complementare cu crRNA și conțin PAM. Ca și în sistemele de tip I, absența PAM în loci CRISPR împiedică tăierea ADN-ului celular. În primul rând, Cas9 recunoaște PAM și apoi ADN-ul adiacent este verificat pentru complementaritatea crARN. Tăierea ADN-ului țintă se realizează prin introducerea a două rupturi monocatenare cu motivele RuvC și HNH ale proteinei Cas9, în urma cărora se formează o ruptură dublu-catenar cu capete contondente la capătul protospacer-ului din R. -bucla cea mai apropiată de PAM, trei nucleotide înainte de PAM [14] .

În sistemele III-C (în special, în sistemul Neisseria meningitidis CRISPR-Cas ), a fost descris un mecanism alternativ pentru biogeneza crRNA care utilizează promotori localizați în repetele CRISPR. Direcția alternativă de transcripție poate apărea chiar și fără participarea RNazei III [14] .

Funcții în afara imunității procariotelor

În ciuda faptului că funcțiile sistemelor CRISPR-Cas sunt de obicei asociate cu imunitatea adaptativă a procariotelor , există o mulțime de dovezi pentru participarea acestor sisteme la procese complet diferite care nu sunt legate de protecția împotriva elementelor genetice străine (de exemplu , în reglarea comportamentului grupului , virulența , repararea ADN-ului și evoluția genomului ). Câteva exemple cunoscute de implicare a CRISPR-Cas în procese non-imune sunt enumerate pe scurt mai jos [38] .

Un exemplu este sistemul CRISPR-Cas din delta-proteobacteria prădătoare Myxococcus xanthus , care este omniprezentă în sol . Ciclul său de viață include etapele formării corpului fructifer și sporulării, în timpul cărora celulele individuale se adună în agregate și se diferențiază în mixospori , formând un corp fructifer. Separând, mixosporii se transformă în celule bacteriene individuale, iar acest proces este strâns reglat de semnalele de detectare a cvorumului și cascadele de semnalizare intracelulară . Sistemul CRISPR-Cas al acestei bacterii aparține tipului IC și include 7 gene Cas și locusul CRISPR care conține 22 distanțieri. Cu o lipsă de nutrienți, sistemul declanșează sinteza în celule a semnalului A, format din aminoacizi și peptide , care activează transcrierea genei fruA ( operonul cas poate activa și această genă prin proteina Cas8c). Când celulele vin în contact unele cu altele, ele formează un semnal C codificat de gena csgA , care activează și fruA , care apoi promovează expresia genelor cas . Astfel, genele cas fac parte din bucla de feedback pozitiv împreună cu gena fruA și sunt implicate în formarea corpului fructifer și sporularea bacteriei [38] .

Sistemele CRISPR-Cas pot fi implicate în reglarea virulenței bacteriilor patogene . De exemplu, Francisella novicida are un sistem de tip II format din patru gene cas și un locus CRISPR orientat invers, care conține 13 distanțieri. Reglează negativ expresia lipoproteinei bacteriene (BLP), un factor de virulență de suprafață. Acesta din urmă este recunoscut de receptorii Toll-like 2 ai sistemului imunitar al gazdei , astfel încât reglarea în jos a BLP este necesară pentru o infecție cu succes. Se presupune că complexul de Cas9, crRNA mic (scaRNA) și tracrRNA se leagă de transcriptul blp și îl distruge printr-un mecanism necunoscut. Sistemele CRISPR-Cas sunt implicate în reglarea virulenței la bacterii precum Campylobacter jejuni , Neisseria meningitidis , Legionella pneumophila (în cazul acestei bacterii, doar cas2 din toate genele cas este implicată în reglarea virulenței ), Listeria monocytogenes ( vezi tabel) [38] .

În multe bacterii, sistemele CRISPR-Cas sunt folosite pentru a-și regla propriile gene care nu sunt legate de virulență. În special, în Pseudomonas aeruginosa , sistemul de tip IF este implicat în reglarea genelor asociate cu formarea biofilmului . În plus, există sugestii că proteinele Cas1 și Cas2 pot oferi protecție împotriva bacteriofagelor, acționând similar sistemelor toxină-antitoxină, adică provocând odihnă și moartea ulterioară a celulelor infectate. Există dovezi pentru implicarea sistemelor CRISPR-Cas în repararea ADN-ului. Astfel, Cas1, care face parte din sistemul de tip E. coli IE , poate interacționa fizic cu enzimele de reparare și recombinare . Ștergerea genei cas1 sau a loci CRISPR asociați a dus la o sensibilitate crescută la agenții care dăunează ADN și la tulburări în segregarea cromozomilor în timpul diviziunii [38] .

Sistemele CRISPR-Cas care vizează cromozomul bacterian pot juca un rol important în rearanjamentele genomice în bacterii și pot oferi baza genetică pentru evoluție  - în ciuda faptului că, în majoritatea cazurilor, proteinele Cas auto-țintite duc la moartea celulelor. În bacteria Pectobacterium atrosepticum , ARNcr care vizează insulele cromozomiale dobândite prin transferul orizontal de gene s-a dovedit că duc în mod obișnuit la moartea celulelor, dar s-au observat deleții cromozomiale mari în unele celule supraviețuitoare, inclusiv îndepărtarea completă a unei insule țintă aproximativ 100. Perechi de baze. În aceste cazuri rare, delețiile au crescut fitness-ul general al mutanților [38] .

În mod interesant, sistemele CRISPR-Cas sunt prezente nu numai în procariote, ci și în bacteriofagi și o serie de alte elemente genetice mobile (MGE). Poate că această circumstanță este asociată cu răspândirea sistemelor CRISPR-Cas în bacterii și arhee prin transfer orizontal de gene. Sistemele CRISPR-Cas ale unor astfel de elemente pot fi direcționate către alte FEM, oferind mecanisme de competiție între FEM. MGE-urile care poartă sisteme CRISPR-Cas pot concura cu insulele de patogenitate bacteriană care sunt din genom în timpul infecției cu fagi și transferate la alte bacterii din capsidele fagilor . Folosind capside fagice pentru propria transmisie, insulele de patogenitate pot bloca complet reproducerea fagilor. Un exemplu este sistemul CRISPR-Cas al fagului ICP1 Vibrio cholerae , care aparține tipului IF și are 2 gene cas și 9 distanțieri (se pare că este omologul sistemului Yersinia pestis ). Unul dintre distanțiere este complementar insulei de patogenitate Vibrio cholerae , astfel încât fagul poate concura cu insulele de patogenitate pentru capside. În plus, sistemul CRISPR-Cas ICP1 poate achiziționa noi distanțieri, ceea ce permite fagului să co-evolueze cu bacteria gazdă [38] [39] .

În 2016, au apărut informații că virusurile mari care conțin ADN nuclear-citoplasmatic au un sistem de protecție asemănător CRISPR și conceput pentru a proteja împotriva virofagelor (în special, virofagul Zamilon din Mimivirus ). Acest sistem de apărare a fost denumit MIMIVIRE [40] .

Opoziție față de CRISPR

S-a stabilit că, ca răspuns la răspândirea anumitor distanțieri CRISPR în populația bacteriană (și, în consecință, la răspândirea rezistenței la bacteriofagii corespunzători), bacteriofagii suferă mutații intense și chiar pierd acele părți ale genomului care servesc cel mai adesea drept ținte. pentru sistemele CRISPR-Cas și se integrează în genomul bacterian ca distanțieri [21] .

Unii fagi codifică proteine ​​specifice (proteine ​​anti-CRISPR, Acr) care interferează cu sistemele CRISPR-Cas și promovează infecția. Analiza fagilor Pseudomonas aeruginosa a făcut posibilă izolarea mai multor varietăți de proteine ​​Acr. Inițial, proteinele Acr au fost descrise în tulpini de P. aeruginosa care poartă profagi în cromozomii lor. Deși majoritatea acestor tulpini au avut un sistem activ IF CRISPR-Cas, la unele tulpini sistemul a rămas inactiv chiar și în prezența distanțierilor care vizează fagi. Analiza moleculară a tulpinilor cu sisteme inactive a relevat o serie de proteine ​​mici codificate de fagi care au fost responsabile pentru dezvoltarea fenotipului care răspunde la fagi . Proteinele Acr pot suprima funcționarea sistemelor CRISPR-Cas în diferite moduri, în special (în cazul sistemelor de tip IF) prin legarea la complexul Cascade și blocarea legării acestuia la ADN-ul țintă sau prin legarea la proteinele Cas, ceea ce duce la pierderea activității lor nucleaze [41] .

Este cunoscută proteina Acr, care împiedică legarea helicazei - nucleazei Cas3 de complexul de ARNcr și alte proteine ​​Cas care s-au legat deja de ADN-ul său țintă. Deoarece complexul de Cas și ARNcr asociat cu ADN-ul nu permite aparatului de transcripție să se lege de ADN, această proteină Acr transformă complexul de ARNcr și Cas într-un represor transcripțional. Din octombrie 2015, acesta este primul exemplu cunoscut de reglare a activității sistemului CRISPR-Cas folosind un factor proteic [42] . Proteinele Acr pot prezenta o specificitate puternică pentru sistemul CRISPR-Cas; în special, proteinele care au blocat sistemul P. aeruginosa IF nu au avut niciun efect asupra sistemului P. aeruginosa IE sau E. coli IF . Cu toate acestea, unii fagi cu gene supresoare pentru sistemul P. aeruginosa IF au codificat și proteine ​​​​supresoare mici care suprimă sistemul P. aeruginosa IE , dar nu și E. coli IE [41] .

Apariția mecanismelor de protecție împotriva interferenței CRISPR în fagi este considerată rezultatul unei lungi coevoluții a fagilor și a gazdelor lor [22] .

Semnificație evolutivă

Potrivit lui E. V. Kunin , funcționarea sistemelor CRISPR-Cas poate fi considerată ca un proces evolutiv care satisface scenariul evolutiv Lamarck , și anume următoarele criterii:

• Modificările genomice în loci CRISPR (inserarea de noi distanțieri) sunt cauzate de influența mediului (mai precis, elemente genetice străine).
• Modificările sunt limitate la loci genomici specifici.
• Modificările asigură adaptarea la un impact specific (la un element genetic străin specific) [43] [44] .

Cu toate acestea, această viziune asupra CRISPR a fost criticată. Potrivit lui A. Wyss, corespondența CRISPR-Cas cu criteriile lamarckiene este doar superficială [43] .

Sistemele CRISPR-Cas prezintă unele dintre proprietățile evoluției darwiniene  - în special, aparițiile la nivel de populație de achiziție aleatorie a distanțierilor, urmată de selecția clonelor supraviețuitoare cu cea mai bună capacitate [21] .

Identificare

Sistemele CRISPR-Cas sunt larg răspândite în rândul bacteriilor și arheilor [45] , iar trăsătura lor caracteristică este alternanța secvențelor repetate și a distanțierilor. Datorită acestei caracteristici, locii CRIPSR sunt destul de ușor de găsit în secvențe lungi de ADN, deoarece odată cu creșterea numărului de repetări într-un locus, probabilitatea unei descoperiri fals pozitive scade. Printre programele utilizate pentru căutarea CRISPR pe baza găsirii de repetări separate prin goluri în secvențe lungi se numără CRT [46] , PILER-CR [47] și CRISPRfinder [48] .

Găsirea CRISPR în datele metagenomice este mai dificilă: folosind algoritmi standard, loci CRISPR nu pot fi colectați din cauza prezenței multor repetări, precum și a variațiilor specifice tulpinii. Reacția în lanț a polimerazei poate fi utilizată pentru a crește numărul de loci CRISPR și apoi pentru a analiza conținutul distanțierilor, dar această metodă oferă doar informații despre un anumit locus CRISPR și este aplicabilă numai organismelor ale căror genomuri sunt disponibile în baze de date (astfel încât primeri adecvați). poate fi creat ) [49] [ 50] [51] [52] [53] .

Aplicații în inginerie genetică

Înainte de descoperirea funcțiilor și mecanismelor de acțiune ale sistemelor CRISPR-Cas ca metode de editare a genomului specific locului, metode bazate pe utilizarea nucleazelor care conțin degete de zinc ( engleză.  Zinc-finger nucleases, ZFNs ), ca precum și endonucleazele TAL , au fost cel mai intens dezvoltate ( Transcription activator-like effector nuclease, TALEN ) .  Aceste metode sunt destul de laborioase, nu foarte eficiente și costisitoare: pentru fiecare nou locus țintă este necesară dezvoltarea, exprimarea și verificarea unei perechi complet noi de polipeptide , ceea ce limitează semnificativ domeniul de aplicare al acestor metode [14] [54] .

Cu toate acestea, în 2012-2013, în inginerie genetică au apărut metode fundamental noi de manipulare a materialului genetic bazate pe utilizarea sistemelor CRISPR-Cas. Aceste metode sunt potrivite pentru editarea țintită a genomurilor atât ale procariotelor, cât și ale eucariotelor (deși acestea din urmă nu au propriile lor sisteme CRISPR-Cas, cu toate acestea, s-a dovedit că elementele sistemului CRISPR-Cas de origine bacteriană au fost introduse artificial într-un eucariot. celulele sunt capabile să funcționeze într-un mediu nou). În același timp, tehnologiile moderne CRISPR-Cas folosesc proteina Cas9, care este aceeași pentru toți locii țintă, iar specificitatea acțiunii este determinată nu de proteină, ci de crRNA. Metodele bazate pe ZFN și TALEN sunt încă utilizate astăzi și chiar sunt preferate pentru cercetarea clinică, dar simplitatea, eficiența și rentabilitatea metodelor care utilizează sistemul CRISPR-Cas9 le-au făcut să fie prima alegere dintre metodele de editare și legare direcționată a genomului. cu ADN [14] [54] .

Metodele bazate pe CRISPR-Cas9 sunt apropiate de mecanismele naturale de acțiune ale acestor sisteme: ARN-ul este utilizat pentru a recunoaște o secvență țintă care este situată în apropierea PAM, iar nucleaza Cas9 direcționată de aceasta produce o rupere dublu-catenar la locul țintă. La editarea genomului eucariotic, totuși, rezultatul muncii CRISPR-Cas9 nu este distrugerea întregii molecule de ADN, ci repararea ruperii duble catene produse de Cas9. Reparația poate fi efectuată atât prin îmbinare la capăt neomolog  ( NHEJ ) cât și prin recombinare omoloagă . Repararea non-omoloage a îmbinării la capăt duce adesea la mici inserții sau deleții care pot perturba cadrul de citire al genelor care codifică proteine, ducând la pierderea funcției genei țintă. Prin producerea multor rupturi dublu-catenare, pot fi realizate ștergeri mari și chiar inversări [14] .

În schimb, repararea prin recombinare omoloagă implică înlocuirea secvenței șterse cu o nouă secvență care este complementară șablonului de reparare pe care cercetătorul însuși îl creează. Astfel, recombinarea omoloagă poate fi utilizată pentru a elimina mutațiile nedorite , a crea noi alele, a insera sau a îmbina domenii funcționale. În plus, inactivarea mutațională a domeniilor RuvC sau HNH Cas9 transformă această proteină într-o nickază direcționată de ARN care produce rupturi monocatenar, mai degrabă decât rupturi dublu-catenar. Inactivarea ambelor domenii transformă Cas9 într-o proteină de legare a ADN-ului ghidată de ARN care nu taie ținta. În acest caz, un domeniu cu alte funcții poate fi atașat la domeniul de legare a ADN-ului, care, la rândul său, poate provoca diverse modificări în locusul țintă: activarea sau reprimarea transcripției, modificarea cromatinei , creșterea formării buclei și multe altele. În plus, forma inactivată a Cas9 (dCas9, Cas9 „mort”) servește ca bază pentru noi tehnici de cercetare, cum ar fi imagistica prin fluorescență sau crearea de etichete pentru izolarea fizică ulterioară a loci [14] .

În ciuda eficienței utilizării sistemelor CRISPR-Cas, originea Cas9 impune unele restricții privind alegerea țintelor ADN: de exemplu, când se utilizează Streptococcus pyogenes Cas9 , numai secvențele urmate de PAM și anume 5’-NGG (unde N este orice nucleotidă). Cu toate acestea, necesitatea PAM nu impune restricții serioase privind utilizarea sistemelor CRISPR-Cas9: în genomul uman, astfel de secvențe apar aproape la fiecare 8-12 nucleotide. Înainte de a fi utilizată în construcții genetice, gena Cas9 ar trebui optimizată preliminar pentru codonii utilizați în conformitate cu organismul al cărui genom se presupune a fi modificat [55] : gena S. pyogenes cas9 are un conținut scăzut de GC (35%), iar pentru organismele ale căror genomi au o compoziție mare de GC, poate fi necesară optimizarea codonului Cas9 [56] .

În prezent, pentru editarea genomului este utilizat sistemul de tip CRISPR-Cas II, iar cel mai des este folosită proteina SpyCas9 (nucleaza Cas9 a bacteriei S. pyogenes ); cu toate acestea, proteine ​​Cas9 alternative sunt în curs de dezvoltare care vor crește domeniul de aplicare al CRISPR-Cas. De exemplu, formele trunchiate de Cas9 pot recunoaște diverse secvențe PAM. Deși editarea genomului poate fi efectuată eficient cu crRNA și tracrRNA transcrise separat, dezvoltarea tehnologiei ARN-ului unic ghid (sgRNA) a simplificat acest sistem. În acest caz, sistemul cu patru componente RNaza III:crRNA:tracrRNA:Cas9 este înlocuit cu sistemul cu două componente sgRNA:Cas9. În prezent, sgRNA este utilizat mult mai frecvent decât crRNA și tracrRNA separate. În cele din urmă, se lucrează pentru îmbunătățirea specificității Cas9 și reducerea efectelor secundare [14] [54] . La începutul anului 2016 au fost publicate rezultatele muncii cercetătorilor americani, care au reușit să reducă numărul erorilor la aproape zero [17] .

Livrarea sgRNA și Cas9 la celulele țintă este asigurată prin diferite metode. De exemplu, plasmidele care codifică ARNsg și Cas9 pot fi utilizate pentru aceasta, iar celulele pot fi transfectate (sau transformate , în cazul procariotelor) cu acestea. Astfel de plasmide pot fi livrate în celule prin electroporare [57] . În unele cazuri, se dovedește a fi mai convenabil să folosești plasmide care codifică Cas9 și să livrezi ARN sub formă de ampliconi generați de PCR [55] .

În 2015, a fost propusă o nouă metodă pentru livrarea sgRNA și Cas9 în celulă în interiorul nanobobinelor speciale. O astfel de nanocoilă constă dintr-un lanț de ADN împletit dens, una dintre secțiunile căreia este complementară sgARN-ului transferat; astfel, complexul sgRNA:Cas9 este fixat în interiorul bobinei. Mai mult, nanobobina este capabilă de auto-asamblare. Multe complexe sgRNA:Cas9 pot fi atașate la o nanocoilă. La contactul cu celula, nanocoil-ul intră în endozom , totuși, un polimer special care acoperă nanocoil asigură distrugerea endozomului și permite sgRNA:Cas9 să ajungă la nucleu [58] .

Modificări de metodă

Pentru editarea dirijată a genomului celulelor eucariote se folosește nu numai Cas9 de S. pyogenes , ci și Cas9 de Streptococcus thermophilus , Neisseria meningitidis [59] [60] , precum și Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9), care este 25 % mai mic decât SpyCas9, ceea ce îi permite să fie ambalat într-un virus adeno-asociat (AAV) pentru livrarea vectorului în celulele unui organism viu ca agent terapeutic [61] .

O formă de Cas9 (dCas9) incapabilă de a tăia ADN-ul și-a găsit o aplicare largă. Utilizarea dCas9 reticulat la o proteină fluorescentă stă la baza noii metode CASFISH ( hibridizare in situ prin fluorescență mediată CRISPR-Cas9 ) , care permite marcarea fluorescentă a locilor țintă [62] . Folosind acest dCas9, se poate urmări lungimea telomerilor , precum și se poate observa dinamica anumitor loci în timpul ciclului celular [63] .

Forma dCas9 poate fi utilizată pentru a suprima transcripția unei gene țintă (când se leagă de aceasta din urmă în regiunea promotor , regiunile de reglare sau începutul regiunii de codificare); în plus, o peptidă represoare poate fi legată la dCas9 pentru a suprima transcripția . Dimpotrivă, dCas9 reticulat cu proteinele de activare a transcripției ( factori de transcripție și efectori [64] ) poate activa transcripția genei țintă. În plus, endonucleazele de restricție artificiale pot fi atașate la dCas9 , precum și enzimele care modifică epigenomul ( ADN metiltransferaze , histonacetiltransferaze ) și, prin urmare, reglează activitatea genelor țintă [65] [66] [67] . În 2016, celulele stem embrionare de șoarece au fost reprogramate în două linii extra-embrionare ( celule endodermice trofoblast și extra-embrionare ) prin activarea genelor Cdx2 și Gata6 folosind activatori mediați de CRISPR [68] .

În plus, dCas9 poate fi reticulat cu monomerul endonucleazei FokI , care funcționează ca dimeri . Dimerii FokI pot introduce rupturi dublu-catenari în secvențele țintă. Două sgRNA sunt utilizate pentru a direcționa dCas9 reticulat la monomerul FokI, ceea ce crește semnificativ acuratețea sistemului. Atunci când doi monomeri, fiecare dintre care este direcționat de propriul sgARN, sunt localizați la o distanță de aproximativ 30 de perechi de baze unul de celălalt, FokI se dimerizează și introduce o rupere dublu-catenar [69] .

Pentru a curăța loci asociați cu ARNsg, se poate folosi dCas9 care poartă anumiți epitopi . De fapt, această metodă este o variantă specială a imunoprecipitării cromatinei [70] .

S-au găsit analogi ai Cas9 care pot scinda moleculele de ARN în loc de ADN. Utilizarea acestor proteine ​​va permite editarea sau suprimarea selectivă a activității miARN -urilor [71] [72] . Francisella novicida Cas9 ( FnCas9) poate fi reprogramată pentru a viza genomul ARN al virusului hepatitei C , ceea ce duce la suprimarea ciclului de viață al virusului în celulele eucariote. Pe baza acestui sistem, este posibil să se creeze sute de agenți împotriva diverșilor viruși [73] .

În toamna anului 2015, a fost propusă o nouă metodă, o alternativă la CRISPR-Cas9 - CRISPR-Cpf1 . Cpf1 este o endonuclează care este o proteină efectoră a sistemelor CRISPR-Cas de tip V. Este mai mic decât Cas9 și necesită doar crRNA pentru a funcționa, nu tracrRNA. În acest sens, este posibil ca în unele cazuri metoda CRISPR-Cpf1 să fie mai convenabilă decât metoda CRISPR-Cas9 [74] .

În 2015 , a fost propusă și o nouă metodă CRISPR de autoclonare .  În acest caz, este introdusă în celule o plasmidă care conține un sgARN palindromic de auto-clonare, precum și un ADN dublu catenar scurt care conține secvența care codifică sgRNA dorit. Când plasmida este transcrisă, ARNsg rezultat complexat cu Cas9 se leagă complementar la secvența din plasmida care codifică ARNsg. Cas9 introduce o rupere dublu catenară, care este reparată prin recombinare omoloagă folosind ADN-ul dublu catenar introdus ca matriță; ca rezultat, plasmida conţine din nou secvenţa care codifică sgARN dorit. Spre deosebire de metoda standard CRISPR, care necesită o producție lungă și laborioasă de plasmide speciale pentru fiecare nou locus țintă, metoda CRISPR de auto-clonare poate reduce timpul de experiment de la șase zile la trei ore și poate reduce costul acestuia de șase ori [75] .

În prezent, metodele chimice sunt dezvoltate intens pentru a controla funcționarea CRISPR-Cas: doză, durata de acțiune, specificitate și alți parametri [76] [77] .

Implicații biotehnologice și medicale

În prezent, metodele CRISPR-Cas sunt utilizate cu succes în ingineria genetică a diferitelor organisme: atât eucariote multicelulare și unicelulare ( drojdie ), cât și procariote [56] [78] . Utilizarea CRISPR-Cas în microorganisme face posibilă modificarea căilor metabolice ale acestora , ceea ce deschide oportunități pentru dezvoltarea de noi strategii biotehnologice [79] . În plus, crearea unor tulpini de bacterii importante din punct de vedere tehnologic rezistente la diverși fagi datorită CRISPR-Cas este de mare importanță pentru biotehnologie [21] .

Au fost dezvoltate metode de editare a genomurilor folosind CRISPR-Cas pentru organisme model (de exemplu, șoareci [80] , musca fructelor Drosophila melanogaster [81] , nematodul Caenorhabditis elegans [82] , peștele zebra [83] și altele). Astfel de metode au fost folosite pentru a edita genomul ciupercilor [84] , în special, a ciupercii filamentoase Aspergillus oryzae , care este folosită în industrie pentru fermentarea soiei [85] și champignon [86] . De mare importanță sunt lucrările de editare cu ajutorul culturilor de celule CRISPR-Cas de mamifere , inclusiv de oameni [87] . În 2017, genomul embrionilor umani a fost editat prin această metodă [88] .

Se lucrează la editarea genomurilor folosind CRISPR-Cas la bovine [89] , porci [90] și alte animale de mare importanță economică, cum ar fi albinele [91] . În noiembrie 2015, au fost publicate rezultatele unui experiment în care 62 de retrovirusuri endogene au fost inactivate în genomul porcului folosind tehnologia CRISPR-Cas . Autorii studiului speră că, datorită acestor rezultate, xenotransplantul de organe de la un porc la un om va deveni posibil în viitor [92] . În cele din urmă, mutageneza CRISPR-Cas poate fi utilizată pentru a controla speciile invazive (de exemplu, musca invazivă Drosophila suzukii)[93].

Tehnologia CRISPR-Cas a fost aplicată cu succes în ingineria genetică a plantelor [94] , inclusiv a plantelor ornamentale (de exemplu, petunii [95] ) și a multor culturi importante: orez [96] , soia [97] , grâu , sorg , porumb . , roșii [98] și portocale [99] . Se cercetează posibilitatea introducerii sistemelor CRISPR-Cas în plantele cultivate pentru a crea imunitate antivirală [100] [101] . Sistemul CRISPR-Cpf1 [102] poate fi folosit și pentru ingineria genetică a plantelor .

Metodele bazate pe CRISPR-Cas pot fi utilizate și în medicină [103] pentru tratamentul unei game largi de boli: virale (inclusiv infecția cu HIV [104] [105] și infecții cu herpesvirus [106] ), alergii și boli imunologice ( inclusiv autoimune [107] ) [108] , oncologice [109] [110] [111] , boli cardiovasculare [112] și chiar reumatism [113] , precum și tulburări ereditare [114]  cum ar fi sindromul Down , anemia cu celule falciforme [ 114] 115] , retinita pigmentară [116] și β-talasemie [117] . În 2013, a apărut o publicație [118] care raportează că cercetătorii au reușit să editeze o genă anormală în celulele stem ale unui pacient cu fibroză chistică . Este posibil ca sistemul CRISPR-Cas să poată ajuta în tratamentul distrofiei musculare Duchenne (DMD): s-a demonstrat că CRISPR-Cas poate restabili gena distrofinei în cultura de celule DMD [119] . Se presupune că astfel de celule cu un genom „reparat” pot fi transplantate în corpul pacientului, unde pot înlocui celulele bolnave și pot îndeplini funcțiile necesare [54] . În octombrie 2016, un genom uman adult a fost editat în China folosind CRISPR/Cas: unui pacient cu cancer pulmonar i sa injectat limfocite T modificate cu CRISPR-Cas [120] . Cercetătorii cred că editarea genomului țânțarului de malarie folosind CRISPR-Cas poate ajuta la combaterea malariei [121] [122] . A fost demonstrată posibilitatea editării genomului unui alt protozoar patogen important, Toxoplasma gondii , folosind CRISPR-Cas [123] .

Sistemul CRISPR-Cas poate fi utilizat pentru a obține țesuturi rezistente la inflamație din celulele pluripotente umane [124] .

Metodele CRISPR-Cas s-au dovedit a fi eficiente în manipularea locusului PRPN , care codifică o proteină prionică responsabilă pentru o serie de boli neurodegenerative la oameni și alte mamifere [125] .

Liniile celulare modificate cu CRISPR-Cas pot fi folosite ca modele pentru diferite boli umane. De exemplu, celulele cu mutații corespunzătoare a două boli de rinichi ( boala polichistică a rinichilor și glomeruloscleroza segmentară focală ) au fost obținute dintr-o linie celulară pluripotentă umană folosind CRISPR-Cas . Mai târziu, din aceste celule au fost cultivate mini-organe corespunzătoare rinichilor unei persoane cu aceste boli [126] . Aceeași metodă a fost folosită pentru a modela sindromul QT lung pe cardiomiocite . Astfel de modele pot ajuta la studiul bolilor și la dezvoltarea de noi medicamente [127] .

Editarea ADN-ului pentru a contracara infecția cu HIV

În noiembrie 2018, a devenit cunoscut faptul că o echipă de oameni de știință chinezi condusă de He Jiankui a reușit să creeze primii oameni din lume cu gene modificate artificial ( CCR5 disabled ) - două fete gemene care ar trebui să fie imune la virusul imunodeficienței umane [128] [129] . Acest experiment a fost criticat pentru încălcarea a numeroase reguli științifice și etice [130] .

Reacția publicului

În 2015, cel puțin patru laboratoare din SUA, laboratoare din China și Marea Britanie , precum și compania americană de biotehnologie Ovascience și-au anunțat planurile de a modifica genomurile embrionilor umani folosind CRISPR-Cas [131] . În lumina acestor evenimente, mulți oameni de știință au susținut introducerea unui moratoriu internațional privind utilizarea tehnologiei CRISPR-Cas în embrionii umani și celulele germinale , inclusiv în scopuri medicale [132] [133] . Acești oameni de știință au susținut continuarea cercetării de bază CRISPR, cu toate acestea, în opinia lor, tehnologia CRISPR-Cas nu este încă suficient de dezvoltată pentru a garanta absența mutațiilor adverse și a defectelor ereditare la pacienți atunci când este aplicată în practica clinică [134] .

În aprilie 2015, un grup de oameni de știință chinezi a publicat un articol în revista Protein & Cell raportând rezultatele încercării lor de a schimba ADN-ul embrionilor umani neviabile folosind CRISPR-Cas. Ei încercau să repare mutația care duce la beta talasemie [15] . Potrivit cercetătorului principal, Nature and Science a respins lucrarea din considerente etice [135] . Rezultatele experimentului nu au fost foarte optimiste din cauza numeroaselor mutații care au apărut în afara genei țintă. Autorii studiului au afirmat că în prezent tehnologia CRISPR-Cas nu este încă gata de utilizare în medicina reproductivă [15] .

În decembrie 2015, la Washington a avut loc Summitul Internațional pentru Editarea Genelor Umane , sub președinția lui David Baltimore . În cadrul acestui summit, reprezentanți ai academiilor naționale de științe din Statele Unite, Marea Britanie și China au discutat problemele etice ale modificării genelor în celulele germinale umane. În timpul întâlnirii, s-a decis continuarea cercetărilor fundamentale și clinice pe temeiuri legale și etice adecvate. O atenție deosebită a fost atrasă asupra diferenței dintre utilizarea clinică a celulelor somatice , în care răspândirea mutațiilor produse este limitată la un singur individ, și celulele germinale , ale căror anomalii genomice pot fi moștenite de următoarea generație. Acestea din urmă pot avea consecințe neprevăzute și de anvergură asupra evoluției umane  , atât genetice, cât și culturale [136] .  

În februarie 2016, un grup de oameni de știință britanici au primit permisiunea de a modifica genetic embrioni umani folosind CRISPR-Cas și metode conexe [137] [138] .

În 2012 și 2013, la începutul descoperirii cu CRISPR în inginerie genetică, metoda CRISPR-Cas a fost nominalizată la premiul Breakthrough of the Year de emisiunea TV Science Magazine . În 2015, a câștigat acest premiu [139] .

Vezi și

• Restritaze artificiale
• Factori de transcripție artificiali
• Transdiferențierea cu un activator mediat de CRISPR
• Cas9

Note

1. ↑ Biomolecule. Sisteme CRISPR: imunizarea procariotelor . (nedefinit)
2. ↑ Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der Oost J., Koonin E. V. Evolution and classification of the CRISPR- Cas systems  // Nature review. microbiologie. - 2011. - Vol. 9, nr. 6. - P. 467-477. - doi : 10.1038/nrmicro2577 . — PMID 21552286 .
3. ↑ Panchin, Alexandru. Homo sapiens: lucrul la greșeli // Popular Mechanics  : jurnal. - 2016. - Mai. - S. 38-41.
4. ↑ Engleză, Max A. Materiale inteligente programabile, sensibile la CRISPR: [ ing. ]  / Max A. English, Luis R. Soenksen, Raphael V. Gayet … [ și colab. ] // Știință : J. - 2019. - Vol. 365, nr. 6455 (23 august). - P. 780-785. - doi : 10.1126/science.aaw5122 . — PMID 31439791 .
5. ↑ Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A.  Secvența de nucleotide a genei iap , responsabilă pentru conversia izoenzimei fosfatazei alcaline în Escherichia coli și identificarea produsului genetic  // Journal of Bacteriology. - 1987. - Vol. 169, nr. 12. - P. 5429-5433. — PMID 3316184 .
6. ↑ 1 2 3 Lander E. S. Eroii din CRISPR  // Cell. - 2016. - Vol. 164, nr. 1-2. - P. 18-28. - doi : 10.1016/j.cell.2015.12.041 . — PMID 26771483 .
7. ↑ Jansen R., Embden J. D., Gaastra W., Schouls L. M.  Identificarea genelor care sunt asociate cu repetițiile ADN la procariote  // Microbiologie moleculară. - 2002. - Vol. 43, nr. 6. - P. 1565-1575. — PMID 11952905 .
8. ↑ Mojica F. J., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E.  Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements  // Journal of Molecular Evolution. - 2005. - Vol. 60, nr. 2. - P. 174-182. - doi : 10.1007/s00239-004-0046-3 . — PMID 15791728 .
9. ↑ Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G.  Elementele CRISPR din Yersinia pestis dobândesc noi repetări prin absorbția preferențială a ADN-ului bacteriofag și oferă instrumente suplimentare pentru studii evolutive  // ​​Microbiologie. - 2005. - Vol. 151, pct. 3. - P. 653-663. - doi : 10.1099/mic.0.27437-0 . — PMID 15758212 .
10. ↑ Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S. D.  Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPR) au distanțieri de origine extracromozomală  // Microbiologie. - 2005. - Vol. 151, pct. 8. - P. 2551-2561. - doi : 10.1099/mic.0.28048-0 . — PMID 16079334 .
11. ↑ Makarova K. S., Grishin N. V., Shabalina S. A., Wolf Y. I., Koonin E. V.  Un presupus sistem imunitar bazat pe interferență ARN la procariote: analiza computațională a mașinilor enzimatice prezise, ​​analogii funcționale cu ARNi eucariote și mecanisme ipotetice de acțiune  directă // Biologie . - 2006. - Vol. 1, nr. 1. - P. 7. - doi : 10.1186/1745-6150-1-7 . — PMID 16545108 .
12. ↑ Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D. A., Horvath P.  CRISPR oferă rezistență dobândită împotriva virusurilor la procariote  // Science. - 2007. - Vol. 315, nr. 5819. - P. 1709-1712. - doi : 10.1126/science.1138140 . — PMID 17379808 .
13. ↑ Omul de știință de la DuPont Philippe Horvath a primit premiul Massry 2015 . (nedefinit)
14. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Sontheimer E. J.,  The Human Revolutioning  / Origine R.R. Terapia genică. - 2015. - Vol. 26, nr. 7. - P. 413-424. - doi : 10.1089/hum.2015.091 . — PMID 26078042 .
15. ↑ 1 2 3 4 Liang Puping, Xu Yanwen, Zhang Xiya, Ding Chenhui, Huang Rui, Zhang Zhen, Lv Jie, Xie Xiaowei, Chen Yuxi, Li Yujing, Sun Ying, Bai Yaofu, Songyang Zhou, Ma Wenbin, Zhou Canquan, Huang Junjiu.  Editarea genelor mediată de CRISPR/Cas9 în zigoți tripronucleari umani  // Protein & Cell. - 2015. - Vol. 6, nr. 5. - P. 363-372. - doi : 10.1007/s13238-015-0153-5 . — PMID 25894090 .
16. ↑ Reardon Sara. Summit-ul de editare genetică sprijină unele cercetări în embrioni umani  // Natură. - 2015. - 3 decembrie. — ISSN 1476-4687 . - doi : 10.1038/nature.2015.18947 .
17. ↑ 1 2 Slaymaker I. M., Gao Linyi, Zetsche B., Scott D. A., Yan W. X., Zhang Feng.  Nucleaze Cas9 proiectate rațional cu specificitate îmbunătățită  // Știință. - 2016. - Vol. 351, nr. 6268.-P. 84-88. - doi : 10.1126/science.aad5227 . — PMID 26628643 .
18. ↑ Severinov, K. Gene Editing for Dummies  : How Jennifer Doudna and Emmanuelle Charpentier's Discovery Changed Biology and Won Them a Nobel Prize: [ arh. 10 octombrie 2020 ] // Forbes. - 2020. - 7 octombrie.
19. ↑ 1 2 Naimark, 2021 .
20. ↑ Kapitonov și colab., 2016 .
21. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Barrangou R.  Rolurile sistemelor CRISPR-Cas în imunitatea adaptivă și dincolo  // Opinia curentă în imunologie. - 2015. - Vol. 32. - P. 36-41. - doi : 10.1016/j.coi.2014.12.008 . — PMID 25574773 .
22. ↑ 1 2 Nemudry A. A., Valetdinova K. R., Medvedev S. P., Zakian S. M.  TALEN și sistemele de editare a genomului CRISPR/Cas sunt instrumente de descoperire  // Acta Naturae . - 2014. - Nr 3 (22) . - S. 20-42 .
23. ↑ Jiang Wenyan, Maniv I., Arain F., Wang Yaying, Levin B. R., Marraffini L. A.  Dealing with the Evolutionary Downside of CRISPR Immunity: Bacteria and Beneficial Plasmids  // PLoS Genetics. - 2013. - Vol. 9, nr. 9. - P. e1003844. - doi : 10.1371/journal.pgen.1003844 . — PMID 24086164 .
24. ↑ 1 2 Samson J. E., Magadan A. H., Moineau S. . Sistemul imunitar CRISPR-Cas și transferurile genetice: atingerea unui echilibru // Plasmide: biologie și impact în biotehnologie și descoperire / Ed. de M. E. Tolmasky, J. C. Alonso. - Washington: ASM Press, 2015. - 718 p. - ISBN 978-1-5558-1897-5 .  - P. 209-218. - doi : 10.1128/microbiolspec.PLAS-0034-2014 . — PMID 26104549 .
25. ↑ Marraffini L. A.  CRISPR-Cas immunity in prokaryotes  // Nature . - 2015. - Vol. 526, nr. 7571. - P. 55-61. - doi : 10.1038/nature15386 . — PMID 26432244 .
26. ^ van Houte S. , Ekroth AK , Broniewski JM , Chabas H. , Ben Ashby , Bondy-Denomy J. , Gandon S. , Boots M. , Paterson S. , Buckling A. , Westra ER Beneficiile generatoare de diversitate ale unui sistemul imunitar adaptativ procariot.  (engleză)  // Natură. - 2016. - doi : 10.1038/nature17436 . — PMID 27074511 .
27. ↑ 1 2 3 Barrangou R.  Diversitatea sistemelor imune CRISPR-Cas și a mașinilor moleculare  // Biologia genomului. - 2015. - Vol. 16. - P. 247-257. - doi : 10.1186/s13059-015-0816-9 . — PMID 26549499 .
28. ↑ 1 2 Makarova K. S., Koonin E. V.  Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems  // Methods in Molecular Biology. - 2015. - Vol. 1311. - P. 47-75. - doi : 10.1007/978-1-4939-2687-9_4 . — PMID 25981466 .
29. ↑ Minina E. Cum se transformă glia în neuroni într-un organism viu  : [ arh. 18 mai 2020 ] / Elizaveta Minina // Neuronovitate. - 2020. - 15 mai.
30. ^ Zhou, H. Conversia Glia-la-Neuron prin CRISPR-CasRx Atenuează Simptomele Bolilor Neurologice la Soareci : [ ing. ]  / H. Zhou, J. Su, X. Hu … [ și colab. ] // Celula : jurnal. - 2020. - Vol. 181, nr. 3 (30 aprilie). — P. 590–603.e16. - doi : 10.1016/j.cell.2020.03.024 . — PMID 32272060 .
31. ↑ Zetsche B. și colab. Cpf1 este o singură endonuclează ghidată de ARN a unui  sistem CRISPR-Cas de clasa 2  // Cell . - Cell Press , 2015. - Vol. 163 , nr. 3 . - P. 759-771 .
32. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Makarova K. S., Wolf Y. I., Alkhnbashi O. S., Costa F., Shah S. A., Saunders S. J., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Haft D. H., Horvath P., Moineau S., Moineau S. F. J., Terns R. M., Terns M. P., White M. F., Yakunin A. F., Garrett R. A., van der Oost J., Backofen R., Koonin E. V.  O clasificare evolutivă actualizată a sistemelor CRISPR-Cas  // Nature review. microbiologie. - 2015. - Vol. 13, nr. 11. - P. 722-736. - doi : 10.1038/nrmicro3569 . — PMID 26411297 .
33. ↑ UniProtKB - Q53VY1 (CSE1_THET8) . (nedefinit)
34. ↑ Cady K. C., O'Toole G. A.  Interacțiunea CRISPR-bacteriofag non-mediată de identitate, mediată prin proteinele Csy și Cas3  // Journal of Bacteriology. - 2011. - Vol. 193, nr. 14. - P. 3433-3445. - doi : 10.1128/JB.01411-10 . — PMID 21398535 .
35. ↑ Cass S. D., Haas K. A., Stoll B., Alkhnbashi O. S., Sharma K., Urlaub H., Backofen R., Marchfelder A., ​​​​ Bolt E. L.  Rolul lui Cas8 în interferența CRISPR de tip I  // Bioscience Reports. - 2015. - Vol. 35, nr. 3. - P. e00197. - doi : 10.1042/BSR20150043 . — PMID 26182359 .
36. ↑ Silas S., Mohr G., Sidote D. J., Markham L. M., Sanchez-Amat A., Bhaya D., Lambowitz A. M., Fire A. Z.  Achiziție directă a distanțierului CRISPR din ARN de către o proteină de fuziune reverse transcriptază-Cas1  // Science . - 2016. - Vol. 351, nr. 6276. - P. 4234. - doi : 10.1126/science.aad4234 . — PMID 26917774 .
37. ↑ Niewoehner O. și colab., & Jinek M/ (2017). Sistemele CRISPR-Cas de tip III produc mesageri secundi oligoadenilați ciclici . Nature doi : 10.1038/nature23467
38. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Westra E. R., Buckling A., Fineran P. C.  Sistemele CRISPR-Cas: dincolo de imunitatea adaptativă  // Nature Reviews. microbiologie. - 2014. - Vol. 12, nr. 5. - P. 317-326. - doi : 10.1038/nrmicro3241 . — PMID 24704746 .
39. ↑ Seed K. D., Lazinski D. W., Calderwood S. B., Camilli A.  Abacteriophage codifică propriul răspuns adaptativ CRISPR/Cas pentru a evita imunitatea înnăscută a gazdei  // Nature . - 2013. - Vol. 494, nr. 7438.-P. 489-491. - doi : 10.1038/nature11927 . — PMID 23446421 .
40. ↑ Levasseur A. , Bekliz M. , Chabrière E. , Pontarotti P. , La Scola B. , Raoult D.  MIMIVIRE este un sistem de apărare în mimivirus care conferă rezistență virofagului  // Nature. - 2016. - Vol. 531, nr. 7593. - P. 249-252. - doi : 10.1038/nature17146 . — PMID 26934229 .
41. ↑ 1 2 van der Oost J., Brouns S. J.  CRISPR sabotage  // Genome Biology. - 2015. - Vol. 16. - P. 248. - doi : 10.1186/s13059-015-0820-0 . — PMID 26553202 .
42. ↑ Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S., Du Mingjian, Rollins M. F., Hidalgo-Reyes Y., Wiedenheft B., Maxwell K. L., Davidson A. R.  Mecanisme multiple pentru inhibarea CRISPR-Cas de către proteinele anti-CRISPR  // natura . - 2015. - Vol. 526, nr. 7571. - P. 136-139. - doi : 10.1038/nature15254 . — PMID 26416740 .
43. ↑ 1 2 Weiss A.  Lamarckian Illusions  // Trends in Ecology & Evolution. - 2015. - Vol. 30, nr. 10. - P. 566-568. - doi : 10.1016/j.tree.2015.08.003 . — PMID 26411613 .
44. ↑ Kunin E. V. . logica cazului. Despre natura și originea evoluției biologice. - M. : Tsentrpoligraf, 2014. - 527 p. - ISBN 978-5-227-04982-7 .  - S. 311.
45. ↑ Chylinski K., Makarova K. S., Charpentier E., Koonin E. V.  Clasificarea și evoluția sistemelor CRISPR-Cas de tip II  // Nucleic Acids Research. - 2014. - Vol. 42, nr. 10. - P. 6091-6105. - doi : 10.1093/nar/gku241 . — PMID 24728998 .
46. ↑ Bland C., Ramsey T. L., Sabree F., Lowe M., Brown K., Kyrpides N. C., Hugenholtz P.  Instrumentul de recunoaștere CRISPR (CRT): un instrument pentru detectarea automată a repetărilor palindromice interspațiate regulat în cluster  // BMC Bioinformatics. - 2007. - Vol. 8. - P. 209. - doi : 10.1186/1471-2105-8-209 . — PMID 17577412 .
47. ↑ Edgar R. C.  PILER-CR: identificarea rapidă și precisă a repetărilor CRISPR  // BMC Bioinformatics. - 2007. - Vol. 8. - P. 18. - doi : 10.1186/1471-2105-8-18 . — PMID 17239253 .
48. ↑ Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C.  CRISPRFinder: un instrument web pentru a identifica repetiții palindromice scurte, interspațiate în mod regulat, grupate  // Nucleic Acids Research. - 2007. - Vol. 35. - P. 52-57. - doi : 10.1093/nar/gkm360 . — PMID 17537822 .
49. ↑ Horvath P., Romero D. A., Coûté-Monvoisin A. C., Richards M., Deveau H., Moineau S., Boyaval P., Fremaux C., Barrangou R.  Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus  // Jurnalul de bacteriologie. - 2008. - Vol. 190, nr. 4. - P. 1401-1412. - doi : 10.1128/JB.01415-07 . — PMID 18065539 .
50. ↑ Pride D. T., Sun C. L., Salzman J., Rao N., Loomer P., Armitage G. C., Banfield J. F., Relman D. A.  Analiza CRISPR streptococice din saliva umană dezvăluie o diversitate substanțială a secvenței în interiorul și între subiecți de-a lungul timpului  // Cercetarea genomului. - 2011. - Vol. 21, nr. 1. - P. 126-136. - doi : 10.1101/gr.111732.110 . — PMID 21149389 .
51. ↑ Pride D. T., Salzman J., Relman D. A.  Comparațiile între repetări palindromice scurte și virome în grupe regulate interspațiate în saliva umană dezvăluie adaptări bacteriene la virusurile salivare  // Microbiologia mediului. - 2012. - Vol. 14, nr. 9. - P. 2564-2576. - doi : 10.1111/j.1462-2920.2012.02775.x . — PMID 22583485 .
52. ↑ Held N. L., Herrera A., Whitaker R. J.  Reassortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus  // Environmental Microbiology. - 2013. - Vol. 15, nr. 11. - P. 3065-3076. - doi : 10.1111/1462-2920.12146 . — PMID 23701169 .
53. ↑ Held N. L., Herrera A., Cadillo-Quiroz H., Whitaker R. J.  Diversitatea asociată CRISPR în cadrul unei populații de Sulfolobus islandicus  // PLoS One . - 2010. - Vol. 5, nr. 9. - P. e12988. - doi : 10.1371/journal.pone.0012988 . — PMID 20927396 .
54. ↑ 1 2 3 4 Vlasov V. V. , Medvedev S. P., Zakian S. M.  „Editori” de genom. De la degetele de zinc la CRISPR  // Știința de primă mână. - 2014. - Nr 2 (56) . - S. 44-53 .
55. ↑ 1 2 Ran F. A., Hsu P. D., Wright J., Agarwala V., Scott D. A., Zhang F.  Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system  // Nature Protocols. - 2013. - Vol. 8, nr. 11. - P. 2281-2308. - doi : 10.1038/nprot.2013.143 . — PMID 24157548 .
56. ↑ 1 2 Peters J. M., Silvis M. R., Zhao Dehua, Hawkins J. S., Gross C. A., Qi L. S.  Bacterial CRISPR: realizări și perspective  // ​​Current Opinion in Microbiology. - 2015. - Vol. 27. - P. 121-126. - doi : 10.1016/j.mib.2015.08.007 . — PMID 26363124 .
57. ↑ Shinmyo Y., Tanaka S., Tsunoda S., Hosomichi K., Tajima A., Kawasaki H.  Knockout al genei mediată de CRISPR/Cas9 în creierul șoarecelui folosind electroporația in utero  // Rapoarte științifice. - 2016. - Vol. 6. - P. 20611. - doi : 10.1038/srep20611 . — PMID 26857612 .
58. ↑ Sun W. , Ji W. , Hall JM , Hu Q. , Wang C. , Beisel CL , Gu Z. Nanoclews ADN auto-asamblate pentru livrarea eficientă a CRISPR-Cas9 pentru editarea genomului.  (engleză)  // Angewandte Chemie (ed. internațională în engleză). - 2015. - Vol. 54, nr. 41 . - P. 12029-12033. - doi : 10.1002/anie.201506030 . — PMID 26310292 .
59. ↑ Hou Zhonggang, Zhang Yan, Propson N. E., Howden S. E., Chu Li-Fang, Sontheimer E. J., Thomson J. A.  Inginerie eficientă a genomului în celulele stem pluripotente umane folosind Cas9 de la Neisseria meningitidis  // Proc. Nat. Acad. sci. SUA . - 2013. - Vol. 110, nr. 39. - P. 15644-15649. - doi : 10.1073/pnas.1313587110 . — PMID 23940360 .
60. ↑ Fonfara I., Le Rhun A., Chylinski K., Makarova K. S., Lécrivain A. L., Bzdrenga J., Koonin E. V., Charpentier E.  Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-ARN and Cas9 between orthologus type II CRISPR-Cas systems  // Cercetarea acizilor nucleici. - 2014. - Vol. 42, nr. 4. - P. 2577-2590. - doi : 10.1093/nar/gkt1074 . — PMID 24270795 .
61. ↑ Ran F. A., Cong Le, Yan W. X., Scott D. A., Gootenberg J. S., Kriz A. J., Zetsche B., Shalem O., Wu Xuebing, Makarova K. S., Koonin E. V., Sharp P. A., Zhang Feng.  Editarea in vivo a genomului folosind Staphylococcus aureus Cas9  // Nature . - 2015. - Vol. 520, nr. 7546. - P. 186-191. - doi : 10.1038/nature14299 . — PMID 25830891 .
62. ↑ Deng Wulan, Shi Xinghua, Tjian R., Lionnet T., Singer R. H.  CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells  // Proc. Nat. Acad. sci. SUA . - 2015. - Vol. 112, nr. 38. - P. 11870-11875. - doi : 10.1073/pnas.1515692112 . — PMID 26324940 .
63. ↑ Chen Baohui, Gilbert L. A., Cimini B. A., Schnitzbauer J., Zhang Wei, Li Gene-Wei., Park J., Blackburn E. H., Weissman J. S., Qi L. S., Huang Bo.  Imagistica dinamică a locilor genomici din celulele umane vii printr-un sistem optimizat CRISPR/Cas  // Cell. - 2013. - Vol. 155, nr. 7. - P. 1479-1491. - doi : 10.1016/j.cell.2013.12.001 . — PMID 24360272 .
64. ↑ Kearns N. A., Genga R. M. J., Enuameh M. S., Garber M., Wolfe S. A., Maehr R. Cas9  reglarea mediată de efector a transcripției și diferențierii în celulele stem pluripotente umane  // Development (Cambridge, Anglia). - 2014. - Vol. 141, nr. 1. - P. 219-223. - doi : 10.1242/dev.103341 . — PMID 24346702 .
65. ↑ Gilbert L. A., Larson M. H., Morsut L., Liu Zairan, Brar G. A., Torres S. E., Stern-Ginossar N., Brandman O., Whitehead E. H., Doudna J. A., Lim W. A., Weissman J. S., Qi L. S.  modular CRISPR-mediated. reglarea dirijată a transcripției la eucariote  // Celulă. - 2013. - Vol. 154, nr. 2. - P. 442-451. - doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . — PMID 23849981 .
66. ↑ Perez-Pinera P., Kocak D. D., Vockley C. M., Adler A. F., Kabadi A. M., Polstein L. R., Thakore P. I., Glass K. A., Ousterout D. G., Leong K. W., Guilak F., Crawford G. E., Reddy RNA C.guie A.  gen . activare de către factorii de transcripție bazați pe CRISPR-Cas9  // Nature Methods. - 2013. - Vol. 10, nr. 10. - P. 973-976. - doi : 10.1038/nmeth.2600 . — PMID 23892895 .
67. ↑ Hilton I. B., D'Ippolito A. M., Vockley C. M., Thakore P. I., Crawford G. E., Reddy T. E., Gersbach C. A.  Editarea epigenomului de către o acetiltransferaza bazată pe CRISPR-Cas9 activează genele de la promotori și amplificatori  // Nature Biotech - 2015. - Vol. 33, nr. 5. - P. 510-517. - doi : 10.1038/nbt.3199 . — PMID 25849900 .
68. ↑ Wei Shu, Zou Qingjian, Lai Sisi, Zhang Quanjun, Li Li, Yan Quanmei, Zhou Xiaoqing, Zhong Huilin, Lai Liangxue. Conversia celulelor stem embrionare în linii extraembrionare prin activatori mediați de CRISPR  // Rapoarte științifice. - 2016. - Vol. 6. - P. 19648. - doi : 10.1038/srep19648 . — PMID 26782778 .
69. ↑ Tsai S. Q., Wyvekens N., Khayter C., Foden J. A., Thapar V., Reyon D., Goodwin M. J., Aryee M. J., Joung J. K.  Dimeric CRISPR ARN-guided FokI nucleazes for very specific genom editing  // Nature Biotechnology. - 2014. - Vol. 32, nr. 6. - P. 569-576. - doi : 10.1038/nbt.2908 . — PMID 24770325 .
70. ↑ Fujita T., Fujii H.  Izolarea eficientă a regiunilor genomice specifice și identificarea proteinelor asociate prin imunoprecipitarea cromatinei mediată de molecule de legare ADN (enChIP) folosind CRISPR  // Comunicații de cercetare biochimică și biofizică. - 2013. - Vol. 439, nr. 1. - P. 132-136. - doi : 10.1016/j.bbrc.2013.08.013 . — PMID 23942116 .
71. ^ O'Connell M. R., Oakes B. L., Sternberg S. H., East-Seletsky A., Kaplan M., Doudna J. A.  Programable ARN recognition and clivage by CRISPR/Cas9  // Nature . - 2014. - Vol. 516, nr. 7530. - P. 263-266. - doi : 10.1038/nature13769 . — PMID 25274302 .
72. ↑ Hale C. R., Zhao Peng, Olson S., Duff M. O., Graveley B. R., Wells L., Terns R. M., Terns M. P.  Scindarea ARN ghidată de ARN de către un complex proteic CRISPR ARN-Cas  // Celulă. - 2009. - Vol. 139, nr. 5. - P. 945-956. - doi : 10.1016/j.cell.2009.07.040 . — PMID 19945378 .
73. ↑ Price A. A., Sampson T. R., Ratner H. K., Grakoui A., Weiss D. S.  țintirea mediată de Cas9 a ARN-ului viral în celulele eucariote  // Proc. Nat. Acad. sci. SUA . - 2015. - Vol. 112, nr. 19. - P. 6164-6169. - doi : 10.1073/pnas.1422340112 . — PMID 25918406 .
74. ↑ Fagerlund R. D., Staals R. H. J., Fineran P. C.  Proteina Cpf1 CRISPR-Cas extinde instrumentele de editare a  genomului // Biologia genomului. - 2015. - Vol. 16. - P. 251. - doi : 10.1186/s13059-015-0824-9 . — PMID 26578176 .
75. ^ Arbab M., Srinivasan S., Hashimoto T., Geijsen N., Sherwood R. I.  Cloning-free CRISPR  // Stem Cell Reports. - 2015. - Vol. 5, nr. 5. - P. 908-917. - doi : 10.1016/j.stemcr.2015.09.022 . — PMID 26527385 .
76. ↑ Maji B. , Moore CL , Zetsche B. , Volz SE , Zhang F. , Shoulders MD , Choudhary A. Multidimensional chemical control of CRISPR-Cas9.  (Engleză)  // Biologie chimică a naturii. - 2016. - doi : 10.1038/nchambio.2224 . — PMID 27820801 .
77. ↑ Hilton IB , Gersbach CA Inginerie genetică: control chimic pentru editarea CRISPR.  (Engleză)  // Biologie chimică a naturii. - 2016. - doi : 10.1038/nchambio.2243 . — PMID 27820804 .
78. ^ Wilkinson R., Wiedenheft B.  A CRISPR method for genome engineering  // F1000 Prime Reports. - 2014. - Vol. 6. - P. 3. - doi : 10.12703/P6-3 . — PMID 24592315 .
79. ↑ Jakočiūnas T., Jensen M. K., Keasling J. D.  CRISPR/Cas9 avansează ingineria fabricilor de celule microbiene  // Ingineria metabolică. - 2016. - Vol. 34. - P. 44-59. - doi : 10.1016/j.ymben.2015.12.003 . — PMID 26707540 .
80. ^ Williams A., Henao-Mejia J., Flavell R. A.  Editing the Mouse Genome Using the CRISPR-Cas9 System  // Cold Spring Harbor Protocols. - 2016. - Vol. 2016, nr. 2. - P. 087536. - doi : 10.1101/pdb.top087536 . — PMID 26832693 .
81. ↑ Ghosh S., Tibbit C., Liu Ji-Long.  Eliminarea eficientă a ARN-urilor necodificatoare lungi de Drosophila prin interferența CRISPR  // Cercetarea acizilor nucleici. - 2016. - doi : 10.1093/nar/gkw063 . — PMID 26850642 .
82. ↑ Schwartz M. L., Jorgensen E. M.  SapTrap, un set de instrumente pentru modificarea genei CRISPR/Cas9 de mare performanță în Caenorhabditis elegans  // Genetică. - 2016. - Vol. 202, nr. 4. - P. 1277-1288. - doi : 10.1534/genetics.115.184275 . — PMID 26837755 .
83. ↑ Li M. , Zhao L. , Page-McCaw PS , Chen W. Zebrafish Genome Engineering Using the CRISPR-Cas9 System.  (ing.)  // Tendințe în genetică : TIG. - 2016. - doi : 10.1016/j.tig.2016.10.005 . — PMID 27836208 .
84. ↑ Krappmann S. CRISPR-Cas9, noul copil pe blocul de biologie moleculară fungică.  (engleză)  // Micologie medicală. - 2016. - doi : 10.1093/mmy/myw097 . — PMID 27811178 .
85. ↑ Katayama T., Tanaka Y., Okabe T., Nakamura H., Fujii W., Kitamoto K., Maruyama J. I.  Dezvoltarea unei tehnici de editare a genomului folosind sistemul CRISPR/Cas9 în ciuperca filamentoasă industrială Aspergillus oryzae  // Biotechnology Letters . - 2015. - Vol. 38, nr. 4. - P. 637-642. - doi : 10.1007/s10529-015-2015-x . — PMID 26687199 .
86. ↑ Steven Hall Editând ciuperca // În lumea științei . - 2016. - Nr. 12. - S. 85-93.
87. ↑ Gaj T. , Schaffer DV Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR-Cas Systems for Genome Engineering in Mammilian Cells.  (ing.)  // Protocoale Cold Spring Harbor. - 2016. - Vol. 2016, nr. 11 . - P. 086868. - doi : 10.1101/pdb.prot086868 . — PMID 27803249 .
88. ↑ Kirill Stasevici. De la inginerie genetică la iubire: ce au făcut biologii în 2017  // Știință și viață . - 2018. - Nr. 1 . - S. 2-7 . (Rusă)
89. ↑ Wang Zhongde.  Ingineria genomului la bovine: progrese tehnologice recente  // Chromosome Research: un jurnal internațional despre aspectele moleculare, supramoleculare și evolutive ale biologiei cromozomilor. - 2015. - Vol. 23, nr. 1. - P. 17-29. - doi : 10.1007/s10577-014-9452-6 . — PMID 25596824 .
90. ↑ Niemann H., Petersen B.  The production of multi-transgenic pigs: update and perspectives for xenotransplantation  // Transgenic Research. - 2016. - P. 1-14. - doi : 10.1007/s11248-016-9934-8 . — PMID 26820415 .
91. ↑ Kohno H. , Suenami S. , Takeuchi H. , Sasaki T. , Kubo T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L.  //  Zoological science. - 2016. - Vol. 33, nr. 5 . - P. 505-512. - doi : 10.2108/zs160043 . — PMID 27715425 .
92. ↑ Yang Luhan, Güell M., Niu Dong, George H., Lesha E., Grishin D., Aach J., Shrock E., Xu Weihong, Poci J., Cortazio R., Wilkinson R. A., Fishman J. A., Church G. .Inactivarea la  nivel de genom a retrovirusurilor endogene porcine (PERV)  // Știință . - 2015. - Vol. 350, nr. 6264. - P. 1101-1104. - doi : 10.1126/science.aad1191 . — PMID 26456528 .
93. ^ Li Fang, Scott M. J.  Mutageneza mediată de CRISPR/Cas9 a loci letali alb și Sex în dăunătorii invazivi, Drosophila suzukii  // Comunicații de cercetare biochimică și biofizică. - 2016. - Vol. 469, nr. 4. - P. 911-916. - doi : 10.1016/j.bbrc.2015.12.081 . — PMID 26721433 .
94. ↑ Schiml S., Puchta H.  Revolutionizing plant biology: multiple ways of genome engineering by CRISPR/Cas  // Plant Methods. - 2016. - Vol. 12. - P. 8. - doi : 10.1186/s13007-016-0103-0 . — PMID 26823677 .
95. ↑ Zhang Bin, Yang Xia, Yang Chunping, Li Mingyang, Guo Yulong.  Exploatarea sistemului CRISPR/Cas9 pentru mutageneza genomului vizat în Petunia  // Rapoarte științifice. - 2016. - Vol. 6. - P. 20315. - doi : 10.1038/srep20315 . — PMID 26837606 .
96. ↑ Ikeda T., Tanaka W., Mikami M., Endo M., Hirano H.-Y.  Generarea de mutanți artificiali ai frunzelor căzute prin tehnologia CRISPR-Cas9 în orez  // Genes & Genetic Systems. - 2016. - Vol. 90, nr. 4. - P. 231-235. - doi : 10.1266/ggs.15-00030 . — PMID 26617267 .
97. ↑ Du Hongyang, Zeng Xuanrui, Zhao Meng, Cui Xiaopei, Wang Qing, Yang Hui, Cheng Hao, Yu Deyue.  Mutageneză țintită eficientă în boabe de soia de către TALENs și CRISPR/Cas9  // Journal of Biotechnology. - 2016. - Vol. 217. - P. 90-97. - doi : 10.1016/j.jbiotec.2015.11.005 . — PMID 26603121 .
98. ↑ Ito Y., Nishizawa-Yokoi A., Endo M., Mikami M., Toki S.  Mutageneză mediată de CRISPR/Cas9 a locusului RIN care limitează maturarea fructelor de tomate  // Comunicații de cercetare biochimică și biofizică. - 2015. - Vol. 467, nr. 1. - P. 76-82. - doi : 10.1016/j.bbrc.2015.09.117 . — PMID 26408904 .
99. ↑ Belhaj K., Chaparro-Garcia A., Kamoun S., Patron N. J., Nekrasov V.  Editing plant genomes with CRISPR/Cas9  // Current Opinion in Biotechnology. - 2015. - Vol. 32. - P. 76-84. - doi : 10.1016/j.copbio.2014.11.007 . — PMID 25437637 .
100. ↑ Ali Z., Abulfaraj A., Idris A., Ali S., Tashkandi M., Mahfouz M. M.  CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants  // Genome Biology. - 2015. - Vol. 16. - P. 238. - doi : 10.1186/s13059-015-0799-6 . — PMID 26556628 .
101. ↑ Zaidi SS , Tashkandi M. , Mansoor S. , Mahfouz MM Engineering Plant Immunity: Using CRISPR/Cas9 to Generate Virus Resistance.  (engleză)  // Frontiere în știința plantelor. - 2016. - Vol. 7. - P. 1673. - doi : 10.3389/fpls.2016.01673 . — PMID 27877187 .
102. ↑ Xu R. , Qin R. , Li H. , Li D. , Li L. , Wei P. , Yang J. Generarea de orez mutant vizat folosind un sistem CRISPR-Cpf1.  (engleză)  // Jurnal de biotehnologie vegetală. - 2016. - doi : 10.1111/pbi.12669 . — PMID 27875019 .
103. ↑ Watters KE , Kirkpatrick J. , Palmer MJ , Koblentz GD Revoluția CRISPR și impactul său potențial asupra securității sănătății globale.  (Engleză)  // Agenții patogeni și sănătatea globală. - 2021. - 16 februarie. - P. 1-13 . - doi : 10.1080/20477724.2021.1880202 . — PMID 33590814 .
104. ↑ Han Yinglun, Li Qingwei.  Progresul aplicării tehnologiei de editare a genomului CRISPR/Cas9 în tratamentul infecției cu HIV-1  // Yi Chuan. - 2016. - Vol. 38, nr. 1. - P. 9-16. - doi : 10.16288/j.yczz.15-284 . — PMID 26787519 .
105. ↑ Harper KN Noi cercetări privind utilizarea CRISPR/Cas9 pentru tratarea HIV.  (engleză)  // SIDA (Londra, Anglia). - 2016. - doi : 10.1097/QAD.0000000000001294 . — PMID 27755113 .
106. ↑ van Diemen FR , Lebbink RJ CRISPR/Cas9, un instrument puternic pentru a viza herpesvirusurile umane.  (engleză)  // Microbiologie celulară. - 2016. - doi : 10.1111/cmi.12694 . — PMID 27860066 .
107. ^ Borges TJ , Murakami N. , Riella LV Current status of alloimmunity. (Engleză)  // Opinie actuală în nefrologie și hipertensiune arterială. - 2016. - Vol. 25, nr. 6 . - P. 556-562. - doi : 10.1097/MNH.0000000000000267 . — PMID 27584931 .  
108. ↑ Goodman MA , Moradi Manesh D. , Malik P. , Rothenberg ME CRISPR/Cas9 în bolile alergice și imunologice.  (Engleză)  // Revizuirea de către experți a imunologiei clinice. - 2016. - P. 1-5. - doi : 10.1080/1744666X.2017.1241711 . — PMID 27687572 .
109. ↑ Chen Sidi, Sanjana N. E., Zheng Kaijie, Shalem O., Lee Kyungheon, Shi Xi, Scott D. A., Song Jun, Pan J. Q., Weissleder R., Lee Hakho, Zhang Feng, Sharp P. A.  Ecran CRISPR la nivel de genom într-un model de mouse de crestere tumorala si metastaze  // Celula. - 2015. - Vol. 160, nr. 6. - P. 1246-1260. - doi : 10.1016/j.cell.2015.02.038 . — PMID 25748654 .
110. ↑ Liu Tang, Shen J. K., Li Zhihong, Choy E., Hornicek F. J., Duan Zhenfeng.  Dezvoltarea și potențialele aplicații ale tehnologiei de editare a genomului CRISPR-Cas9 în sarcom  // Cancer Letters. - 2016. - Vol. 373, nr. 1. - P. 109-118. - doi : 10.1016/j.canlet.2016.01.030 . — PMID 26806808 .
111. ↑ Wang Dayong, Ma Ning, Hui Yang, Gao Xu.  Aplicarea tehnologiei de editare a genomului CRISPR/Cas9 în cercetarea cancerului  // Yi Chuan. - 2016. - Vol. 38, nr. 1. - P. 1-8. - doi : 10.16288/j.yczz.15-252 . — PMID 26787518 .
112. ↑ Li Y. , Song YH , Liu B. , Yu XY Aplicația potențială și provocarea sistemului CRISPR/Cas9 puternic în cercetarea cardiovasculară.  (engleză)  // Jurnalul internațional de cardiologie. - 2016. - doi : 10.1016/j.ijcard.2016.11.177 . — PMID 27847153 .
113. ↑ Duroux-Richard I. , Giovannangeli C. , Apparailly F. CRISPR-Cas9: O revoluție în editarea genomului în bolile reumatice.  (engleză)  // Articulație, os, coloană vertebrală: revue du rhumatisme. - 2016. - doi : 10.1016/j.jbspin.2016.09.012 . — PMID 27825565 .
114. ↑ Wojtal D., Kemaladewi D. U., Malam Z., Abdullah S., Wong T. W. Y., Hyatt E., Baghestani Z., Pereira S., Stavropoulos J., Mouly V., Mamchaoui K., Muntoni F., Voit T. , Gonorazky H. D., Dowling J. J., Wilson M. D., Mendoza-Londono R., Ivakine E. A., Cohn R. D. Spell Checking Nature: Versatility of CRISPR/Cas9 for Developing Treatments for Inherited Disorders  // American Journal of Human Genetics. - 2016. - Vol. 98, nr. 1. - P. 90-101. - doi : 10.1016/j.ajhg.2015.11.012 . — PMID 26686765 .
115. ↑ Yin Hao, Xue Wen, Chen Sidi, Bogorad R. L., Benedetti E., Grompe M., Koteliansky V., Sharp P. A., Jacks T., Anderson D. G.  Editarea genomului cu Cas9 la șoarecii adulți corectează o mutație a bolii și un fenotip  // Natura biotehnologie. - 2014. - Vol. 32, nr. 6. - P. 551-553. - doi : 10.1038/nbt.2884 . — PMID 24681508 .
116. ↑ Bassuk A. G., Zheng A., Li Yao, Tsang S. H., Mahajan V. B.  Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-Derived Stem Cells  // Scientific Reports. - 2016. - Vol. 6. - P. 19969. - doi : 10.1038/srep19969 . — PMID 26814166 .
117. ^ Yang Y. , Zhang X. , Yi L. , Hou Z. , Chen J. , Kou X. , Zhao Y. , Wang H. , Sun XF , Jiang C. , Wang Y. , Gao S. Naïve Induced Pluripotent Celulele stem generate din fibroblaste de β-talasemie permit corectarea eficientă a genelor cu CRISPR/Cas9.  (Engleză)  // Medicina translațională a celulelor stem. - 2016. - Vol. 5, nr. 1 . - P. 8-19. - doi : 10.5966/sctm.2015-0157 . — PMID 26676643 .
118. ↑ Schwank G., Koo Bon-Kyoung, Sasselli V., Dekkers J. F., Heo I., Demircan T., Sasaki N., Boymans S., Cuppen E., van der Ent C. K., Nieuwenhuis E. E. S., Beekman J. M., Clevers, H.  Repararea funcțională a CFTR de către CRISPR/Cas9 în organoizi de celule stem intestinale ale pacienților cu fibroză chistică  // Cell Stem Cell. - 2013. - Vol. 13, nr. 6. - P. 653-658. - doi : 10.1016/j.stem.2013.11.002 . — PMID 24315439 .
119. ↑ Maggio I. , Liu J. , Janssen JM , Chen X. , Gonçalves MA Vectorii adenovirali care codifică multiplexurile CRISPR/Cas9 salvează sinteza distrofinei în populații neselectate de celule musculare DMD.  (engleză)  // Rapoarte științifice. - 2016. - Vol. 6. - P. 37051. - doi : 10.1038/srep37051 . — PMID 27845387 .
120. ↑ Cyranoski David. Editarea genelor CRISPR testată la o persoană pentru prima dată  // Natură. - 2016. - 15 noiembrie ( vol. 539 , nr. 7630 ). - S. 479-479 . — ISSN 0028-0836 . - doi : 10.1038/nature.2016.20988 .
121. ↑ McLean K. J., Jacobs-Lorena M.  Genetic Control of Malaria Mosquitoes  // Trends in Parasitology. - 2016. - Vol. 32, nr. 3. - P. 174-176. - doi : 10.1016/j.pt.2016.01.002 . — PMID 26809567 .
122. ↑ Carrasquilla M. , Owusu CK A CRISPR outlook for apicomplexans.  (engleză)  // Recenzii de natură. microbiologie. - 2016. - Vol. 14, nr. 11 . - P. 668. - doi : 10.1038/nrmicro.2016.153 . — PMID 27795546 .
123. ^ Shen B. , Brown K. , Long S. , Sibley LD Development of CRISPR/Cas9 for Efficient Genome Editing in Toxoplasma gondii.  (engleză)  // Metode în biologie moleculară (Clifton, NJ). - 2017. - Vol. 1498. - P. 79-103. - doi : 10.1007/978-1-4939-6472-7_6 . — PMID 27709570 .
124. ↑ Brunger JM , Zutshi A. , Willard VP , Gersbach CA , Guilak F. Editarea CRISPR/Cas9 a celulelor stem pluripotente induse pentru ingineria țesuturilor rezistente la inflamație.  (engleză)  // Artrita și reumatologie (Hoboken, NJ). - 2016. - doi : 10.1002/art.39982 . — PMID 27813286 .
125. ^ Kaczmarczyk L. , Mende Y. , Zevnik B. , Jackson W.S. Manipularea secvenței și nivelurilor de expresie a genei proteinei prionice cu CRISPR/Cas9. (Engleză)  // Public Library of Science ONE. - 2016. - Vol. 11, nr. 4 . — P.e0154604. - doi : 10.1371/journal.pone.0154604 . — PMID 27128441 .  
126. ↑ Freedman B. S., Brooks C. R., Lam A. Q., Fu Hongxia, Morizane R., Agrawal V., Saad A. F., Li M. K., Hughes M. R., Werff R. V., Peters D. T., Lu Junjie, Baccei A., Siedlecki A. M., Musus A.M. K., McNagny K. M., Steinman T. I., Zhou Jing, Lerou P. H., Bonventre J. V.  Modelarea bolii renale cu organoizi renali mutanți CRISPR derivati ​​din sferoizi epiblasti umani pluripotenți  // Nature Communications. - 2015. - Vol. 6. - P. 8715. - doi : 10.1038/ncomms9715 . — PMID 26493500 .
127. ↑ Bellin M., Casini S., Davis R. P., D'Aniello C., Haas J., Ward-van Oostwaard D., Tertoolen L. G. J., Jung C. B., Elliott D. A., Welling A., Laugwitz K.-L., Moretti A., Mummery C. L.  Perechile de celule stem pluripotente umane izogenice dezvăluie rolul unei mutații KCNH2 în sindromul QT lung  // The EMBO Journal. - 2013. - Vol. 32, nr. 24. - P. 3161-3175. - doi : 10.1038/emboj.2013.240 . — PMID 24213244 .
128. ↑ Antonio Regalado. EXCLUSIV: Oamenii de știință chinezi creează  copii CRISPR . MIT Technology Review. Preluat: 1 februarie 2019.
129. ↑ Autoritățile chineze confirmă nașterea unor copii modificați genetic și o altă sarcină . Interfax (21 ianuarie 2019). Preluat: 31 ianuarie 2019. (Rusă)
130. ↑ Kolata, Gina . De ce sunt oamenii de știință atât de supărați de primii bebeluși Crispr?  (engleză) , The New York Times  (5 decembrie 2018). Preluat la 1 februarie 2019.
131. ↑ Antonio Regalado. Inginerea copilului perfect . MIT Technology Review (5 martie 2015). Preluat: 23 februarie 2016. (nedefinit)
132. ↑ Baltimore D., Berg P., Botchan M., Carroll D., Charo R. A., Church G., Corn J. E., Daley G. Q., Doudna J. A., Fenner M., Greely H. T., Jinek M., Martin G. S., Penhoet E. , Puck J., Sternberg S. H., Weissman J. S., Yamamoto K. R.  Biotechnology. O cale prudentă înainte pentru ingineria genomică și modificarea genelor liniei germinale  // Știință . - 2015. - Vol. 348, nr. 6230. - P. 36-38. - doi : 10.1126/science.aab1028 . — PMID 25791083 .
133. ↑ Lanphier E. , Urnov F. , Haecker SE , Werner M. , Smolenski J. Don't edit the human germ line.  (engleză)  // Natură. - 2015. - Vol. 519, nr. 7544 . - P. 410-411. - doi : 10.1038/519410a . — PMID 25810189 .
134. ↑ Nicholas Wade . Oamenii de știință caută interzicerea metodei de editare a genomului uman , The New York Times  (19 martie 2015). Recuperat la 20 martie 2015.  „Biologii care scriu în Science susțin continuarea cercetărilor de laborator cu tehnica și puțini oameni de știință cred că este gata pentru utilizare clinică”.
135. ↑ Oamenii de știință chinezi modifică genetic embrionii umani . Natura (22 aprilie 2015). (nedefinit)
136. ↑ Summit-ul internațional privind editarea genetică . Academiile Naționale de Științe, Inginerie și Medicină (3 decembrie 2015). Preluat: 3 decembrie 2015. (nedefinit)
137. ↑ James Gallagher . Oamenii de știință obțin „editarea genetică” , BBC News , BBC (1 februarie 2016). Preluat la 1 februarie 2016.
138. ↑ Maria Cheng . Marea Britanie aprobă tehnica controversată de editare a genelor , AP News  (1 februarie 2016). Preluat la 1 februarie 2016.
139. ↑ Personalul Știrilor Științe. Iar descoperirea anului a științei este... . news.sciencemag.org (17 decembrie 2015). Preluat: 21 decembrie 2015. (nedefinit)

Literatură

• CRISPR-Cas Systems: ARN-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea  : [ ing. ]  / Eds.: Rodolphe Barrangou, John van der Oost. - Springer Berlin Heidelberg, 2013. - X + 302 p. — ISBN 978-3-642-34656-9 . - ISBN 978-3-642-42929-3 . - ISBN 978-3-642-34657-6 . - doi : 10.1007/978-3-642-34657-6 .
• CRISPR-Cas9  : Ingineria unei revoluții în editarea genelor : [ ing. ] // Știință. - 2014. - Vol. 345, nr. 6204. - P. 1638. - doi : 10.1126/science.345.6204.1638-d .
• Makarova, KS Clasificarea și nomenclatura sistemelor CRISPR-Cas: De unde de aici?  : [ engleză ] ]  / KS Makarova, YI Wolf, EV Koonin // Jurnalul CRISPR. - 2018. - Vol. 1, nr. 5. - P. 325-336. - doi : 10.1089/crispr.2018.0033 . — PMID 31021272 . — PMC 6636873 .
• Naimark, E. Sistemele de tip CRISPR-Cas9 sunt răspândite și au multe variante  : [ arh. 21 septembrie 2021 ] // Elemente. - 2021. - 21 septembrie.
• Kapitonov, VV ISC, un nou grup de transpozoni ADN bacterieni și arheali care codifică omologii Cas9 : [ ing. ]  / VV Kapitonov, KS Makarova, EV Koonin // Journal of Bacteriology. - 2016. - Vol. 198, nr. 5. - P. 797-807. - doi : 10.1128/JB.00783-15 . — PMID 26712934 . — PMC 4810608 .

Link -uri

• Serverul web CRISPR (baza de date online pe CRISPR) (link nu este disponibil) . Consultat la 14 noiembrie 2013. Arhivat din original pe 9 noiembrie 2013. (nedefinit) 
• Jurnalul CRISPR Jurnalul științific dedicat CRISPR . (nedefinit)
• Artamonova, Irena; Gogleva, Anna. Sisteme CRISPR: imunizarea procariotelor . // Site-ul Biomolecula.ru (14 noiembrie 2014). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)
• Minina, Elizabeth. Anti-CRISPR: răspunsul virușilor . // Site Biomolecula.ru (6 decembrie 2017). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)
• Borzov, Nikita. Bătălia secolului: CRISPR vs HIV . // Site-ul Biomolecula.ru (11 octombrie 2016). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)
• Shmakova, Anna. CRISPR/​Cas9 ca ajutor în lupta împotriva HIV . // Site-ul Biomolecula.ru (19 octombrie 2016). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)
• Korotaev, Alexandru; Volkova, Olga. Cam despre complex: CRISPR/​Cas . // Site Biomolecula.ru (24 noiembrie 2016). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)
• Krotov, Anton. De la cuvinte la fapte: tehnologia CRISPR-Cas a fost folosită pentru prima dată pentru a trata cancerul . // Site-ul Biomolecula.ru (25 noiembrie 2016). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)
• Kondratenko, Iulia. Au fost găsite sisteme CRISPR care utilizează transcrierea inversă . // Website Biomolecula.ru (9 martie 2016). Preluat: 30 mai 2018. (nedefinit)

Dicționare și enciclopedii	mare chinezesc mare chinezesc
În cataloagele bibliografice	BNF : 169411795 LCCN : sh2018000091 SUDOC : 181652293 , 18418231X